神经营养因子-3联合全反式维甲酸与β-巯基乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化效果比较

张杰，秦华丽，蒋明

（1.温州医科大学附属第一医院 耳鼻咽喉头颈外科，浙江 温州 325015；2.长沙市妇幼保健院 耳鼻咽喉头颈外科，湖南 长沙 410007；3.中南大学湘雅三医院 耳鼻咽喉头颈外科，湖南 长沙 410013）

近年来骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）治疗神经退行性病变日益受到学者重视。BMSCs具有高度自我复制能力和多向分化潜能，且在适宜条件下能向神经元样细胞分化[1]。目前最常见的诱导剂为神经营养因子与化学制剂。本研究比较碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）预诱导后，再用神经营养因子-3（neurotrophin-3，NT-3）联合全反式维甲酸（retinoic acid，RA）与β-巯基乙醇（beta-mercaptoethanol，β-BME）进行分步诱导的方法来体外诱导BMSCs向神经元样细胞分化的效果差异。

1 材料和方法

1.1 材料 澳洲胎牛血清、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青链霉素购自美国Gibco公司；PE anti-rat CD29、CD90、CD45、IgG1购自美国BioLegend公司；β-BME、bFGF、RA、NT-3购自美国PeProtech公司；Cy3标记山羊抗兔IgG（H+L）购自上海碧云天公司；L-DMEM培养基购自美国Hyclone公司；大鼠抗山羊神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific endase，NSE）购自武汉博士德公司；4～6周龄，40～60 g雄性SD大鼠购自中南大学湘雅三医院动物实验中心，动物许可证号为SYXK（湘）2014-0013。

1.2 方法

1.2.1 分离培养大鼠BMSCs：用腹腔注射水合氯醛麻醉后，无菌条件下取大鼠股骨和胫骨，用2 mL注射器抽取含10%胎牛血清的DMEM培养基反复冲洗骨髓，离心去上清，以1×105个/mL的细胞密度接种于25 cm2细胞透气培养瓶内，置于饱和CO2，湿度5%，37 ℃恒温培养箱内培养。按照8 h首次换液，后3 d换液1次的方法，待细胞长满后传代。每日在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.2.2 BMSCs表面标记分子的鉴定：待P3代BMSCs长满瓶底90%以上时，胰酶消化后移入15 mL离心管内，1 000 r/min，离心5 min，PBS重悬细胞，重复3次，调节细胞密度到1×106个/mL，分别加入抗体试剂PE-CD29、PE-CD90、PE-CD45各3管，及1管PEIgG1，置冰上避光孵育30 min。4 ℃，2 000 r/min，离心5 min，弃上清，PBS重悬，重复3次，洗净未结合的抗体。每管加入200 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，重复3次，CELLQUEST软件分析结果。

1.2.3 体外诱导BMSCs向神经元样细胞分化：取P3代BMSCs胰酶消化后，按8×103个/mL的密度接种于预先放有消毒盖玻片的6孔板内制备细胞爬片，加完全培养液2 mL，待细胞60%～70%融合。用预诱导液2 mL（98% L-DMEM+2% FBS+10 ng/mL bFGF[2]）诱导24 h后，随机分为A组（NT-3+RA，换用98% LDMEM+2% FBS+20 ng/mL NT-3+0.5 μmol/L RA[3]）和B组（β-BME，换用98% L-DMEM+2% FBS+1 mmol/L β-BME[3]），2组各用2 mL诱导剂诱导1 h、5 h、24 h、7 d、14 d、21 d后于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。

1.2.4 细胞免疫荧光鉴定：取细胞爬片用PBS洗3次，5 min/次，再用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，5 min/次，再用0.5% Triton-X100浸泡打孔15 min，PBS洗2次，5 min/次，后用封闭液封闭，4 ℃冰箱过夜。加已用封闭液稀释的一抗200 μL，37 ℃避光孵育3 h。用含0.1% Triton-X100的PBS漂洗4次，5 min/次。加入已用PBS稀释的二抗200 μL，37 ℃避光孵育1 h。用含0.1% Triton-X100的PBS漂洗4次，5 min/次。用ddH2O按1∶2 000稀释的DAPI，避光染色5 min；PBS漂洗4次，5 min/次，甘油封片，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。随机选择10个非重叠视野，分别计算诱导后1 h、5 h、24 h、7 d、14 d、21 d的NSE阳性率（NSE染色阳性率=阳性细胞数/总细胞数）。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料用表示，同组内不同时间点比较用单因素重复测量方差分析，相同时间点2组间比较用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs原代培养和传代培养结果 刚接种的BMSCs呈圆形，大部分悬浮在培养液中。各个时间段的BMSCs形态见图1。

2.2 BMSCs表面标志物鉴定结果 由流式细胞仪检测，CD45 PE阳性率分别为8.34%、6.95%、6.94%，平均7.41%；CD90 PE阳性率分别为99.98%、99.98%、99.98%，平均99.98%；CD29 PE阳性率分别为98.21%、98.32%、97.20%，平均97.91%；故CD29 PE、CD90 PE为阳性表达，CD45 PE为阴性表达。见图2。

图1 BMSCs原代培养和传代培养结果（×100）

图2 BMSCs表面标志物流式鉴定结果

2.3 BMSCs诱导后细胞形态学变化 A组加NT-3+RA诱导1 h，少数胞体有轴突样改变，见图3A；诱导5 h细胞漩涡样生长，部分胞体轴突明显延伸，较前增多，并出现少许多角形细胞，见图3B；诱导24 h细胞数量增多，出现少许胞体变圆的细胞，见图3C；诱导至7 d大多数细胞胞体变圆，可有双触角或多触角细胞，可呈多角形，内可见2～3个核仁。胞间漩涡状趋势逐渐消失，部分细胞间相互连接交织成桥梁状，见图3D；诱导至14 d细胞突起较前明显延长，并出现一、二级分支，形成双级或多极的突起，突起间互相连接，呈网络状，见图3E；诱导21 d，仍可见少许存活的神经元样细胞，其连接的突起变细，细胞桥梁趋向断离，其中部分细胞出现颗粒及空泡，呈死亡趋势，见图3F。B组加β-BME诱导1 h，部分胞体呈短棒形或圆形，见图4A；5 h时见胞体可呈双触角或多触角样改变，有些亦见双核仁，部分细胞胞质中出现颗粒和空泡，见图4B；24 h时见悬浮的细胞碎片增多，大部分细胞胞体破裂，趋向老化死亡，见图4C。

图3 BMSCs经NT-3+RA诱导后各时间点细胞形态学变化（×100）

2.4 2组BMSCs的NSE表达情况比较 免疫荧光结果示，A组诱导分化24 h和B组诱导分化5 h后NSE均阳性表达，见图5。

图4 BMSCs经β-BME诱导后细胞学形态变化（×100）

图5 2组NSE免疫荧光鉴定结果（×200）

B组在诱导24 h后大部分细胞死亡。经统计学分析，A组诱导分化7 d后达到高峰，NSE表达率为（81.92±5.02）%，与其他时间点比较差异有统计学意义（P＜0.01）。B组诱导5 h后NSE表达最高，与1 h比较差异有统计学意义（P＜0.01）。在1 h和5 h B组NSE表达率高于A组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

3 讨论

BMSCs起源于中胚层组织，是一种具有多分化潜能的非造血干细胞，在一定条件下可以被诱导分化为外胚层起源的神经元样细胞。已有研究发现BMSCs分化的神经元样细胞能修复受损的神经[4]，并且移植后能为自身修复提供支架[5]，因此BMSCs可以作为治疗神经退行性疾病的理想种子细胞。

随着研究的不断深入，研究者发现了很多种BMSCs向神经元样细胞分化的诱导剂，主要有：RA、抗氧化剂（β-BME[3]、褪黑素、丁羟茴醚、二甲亚砜等）、神经营养因子及生长因子[3]（NT-3和bFGF）、中药[6]等。但其诱导机制仍然不明确。其中，RA能催化胚胎干细胞定向诱导分化为神经元，能调控细胞的生长增殖及分化，有很强的诱导剂功能[7]，能和生长因子联合，增加神经细胞的合成[8]。β-BME为强抗氧化剂，可以通过提高胞内cAMP水平[9]，进一步诱导BMSCs转变成神经细胞样形态。bFGF是一种具有多种功能的多肽生长因子，可以促使BMSCs向神经元样细胞分化[1]，参与分化启动，细胞的生长、发育和组织损伤的修复[10]，可能与wnt信号通路相关[11]。而NT-3作为神经营养素家族中的一员，在诱导BMSCs向神经元样细胞转化过程中非常重要[12]。

为了寻找BMSCs的最佳诱导方案，获得更佳的诱导结果，研究者采用了各种研究方案去提高诱导率，但是不同的诱导剂，其转化效率大为不同，如：FGF-RA方案[13]阳性分化率约为40%，而BME-RA方案[14]的分化率约为20%。而且不同研究者可能因操作手法的差别，即使采用相同的方法也可能得出不同的诱导率[15]。此外，DEZAWA等[16]的研究表明联合诱导分化高于单独诱导分化，HERMANN等[17]的研究结果则证实分步诱导优于单一步骤诱导，且能够获得较高的分化效率。

表1 BMSCs诱导分化成神经元样细胞NSE阳性表达率（，%）

表1 BMSCs诱导分化成神经元样细胞NSE阳性表达率（，%）

与同组内其他时间点比：aP＜0.01；与A组同时间点比：bP＜0.01

组别 n 1 h 5 h 24 h 7 d 14 d 21 d A组 3 1.60±0.44 5.53±1.21 18.55±0.55 81.92±5.02a 68.98±2.41 15.72±1.90 B组 3 6.09±0.76b 15.41±2.11ab — — — —

刘谦虚[18]的研究认为RA诱导稳定表达脑源性神经营养因子的BMSCs表达NSE阳性率高于单独的RA诱导，且单用RA与不加诱导剂的空白对照组无明显变化，故本研究采取分步诱导+联合诱导，bFGF预诱导24 h后，再换用NT-3+RA及β-BME诱导，探索相对较好的诱导方案。结果发现2组均能诱导BMSCs向神经元样细胞分化，但是NT-3+RA组细胞存活时间较β-BME组显著延长，故后期诱导分化率较β-BME组高，但β-BME组短期诱导分化率较高。这些结果与前人研究基本一致。有学者认为[19]化学药物可导致BMSCs的肌动蛋白网络断裂，并引起细胞质回缩，可有似神经元细胞样伸出轴突的假象，这也可能是β-BME诱导后细胞生存时间短的原因。而NT-3+RA组细胞存活时间长，而且后期分化率高，可能与NT-3的神经营养作用有关。故NT-3+RA方案较β-BME方案更佳。但考虑到诱导剂还存在可能的致畸性[3]，而且移植的细胞在中枢神经系统存活时间较短暂[15]，故诱导的BMSCs能否通过移植来治疗神经退化性疾病仍需进一步实验来证实。