补肾壮骨方防治芳香化酶抑制剂引起的骨代谢异常的临床研究

殷玉莲 张卫红 周悦 叶媚娜 陈红风*

1.上海中医药大学附属龙华医院中医乳腺科，上海 200032 2.上海市宝山区中西医结合医院乳腺外科，上海 201901

乳腺癌是威胁当代女性身心健康的常见恶性肿瘤之一，且其发病率呈上升趋势[1-2]。研究显示，乳腺癌患者中约有60%～75%患者激素受体(Hormone receptor，HR)阳性，内分泌治疗是常见的有效治疗方式。其中，芳香化酶抑制剂(Aromatase Inhibitor，AI)已成为绝经后激素受体阳性乳腺癌的标准辅助内分泌治疗。 AIs相比于他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)能进一步降低乳腺癌患者复发风险，使其获得更长的生存期[3]。但AI治疗所带来的骨代谢异常、全身骨关节酸痛、骨质疏松、甚至骨折等直接影响了患者应用AI治疗的依从性及日常生活质量。这一系列变化被称为芳香化酶抑制剂相关骨丢失(Aromatase Inhibitors-associated Bone Loss，AIBL)。本研究通过随机对照的方法探究补肾壮骨方防治芳香化酶抑制剂相关骨丢失(AIBL)的防治作用及安全性，分析其与ERα基因rs9340799、rs2 234693两个位点单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)的相关性，试从基因层面为补肾壮骨方防治AIBL的机制研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 分组方法及临床资料

116例均来自上海中药大学附属龙华医院中医乳腺科2015年10月至2017年4月期间门诊及住院的乳腺癌术后AIs治疗的患者。并设分层条件：①绝经时间≤10年、>10年；②接受AIs治疗时间<1年、1-2年。随机均分为2组，临床基本资料分析，见表1。

1.2 ERα基因SNPs位点检测

入组对象均抽取清晨空腹外周静脉血2 mL，将其置于无菌无酶的EDTA抗凝试管，存放于-20 ℃。引物均由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成，对目标片段进行PCR扩增[3]，ERα基因PCR产物琼脂糖电泳观察图，见图1。

表1 治疗组与对照组临床基本资料分析Table 1 The basic clinical data of the treatment group and control group

图1 ERα基因PCR产物琼脂糖电泳观察图Fig.1 The agarose electrophoresis map of PCR product of ERα gene

所有位点的基因测序由生工生物工程(上海)有限公司进行统一测定，测序仪型号为3730XL(美国ABI)，结果使用Seqman、Chromas软件分析，见图2、3。

图2 ERα基因rs9340799位点测序图Fig.2 The sequencing map of rs9340799 site of ERα gene

图3 ERα基因rs2234693位点测序图Fig.3 The sequencing map of rs2234693 site of ERα gene

1.3 骨密度及骨代谢指标测定

采用双能X线吸收法测量腰椎(L1-L4)、股骨BMD(生产公司：HOLOGIC，型号：QDR4500)，按常规腰椎、股骨检测条件及体位，并对年龄、BMI指数等影响BMD的因素进行修正。每日开机后均用模体校正，错误率为0.5%，常年错误率<1%。应用酶联免疫吸附法测定I型前胶原氨基前端肽以及β-I型胶原羧基端肽。

1.4 治疗与实施

所有患者给予标准剂量的第三代AIs(阿那曲唑、来曲唑、依西美坦)，同时常规补充钙剂和维生素D。

对照组：辨证施用中药汤剂治疗，组方中避免使用补肾中药(即使研究中辨证为肾虚的患者，既随机分入对照组，故组方中规避使用补肾功效的中药)。治疗组：辨证中药汤剂的基础上加用补肾壮骨方(仙灵脾15 g、补骨脂15 g、骨碎补15 g、菟丝子15 g、淮牛膝30 g)。用法用量：由上海中医药大学附属龙华医院煎药室煎制，水煎400 mL，日1剂，分早晚2次，餐后1小时温服。3个月为1个疗程，观察2个疗程。

1.5 安全性检测

观测一般生命体征、血常规、肝肾功能等血液指标及可能发生的不良反应。治疗前后均检测一次性激素水平。观察有无骨折的发生，肿瘤有无进展及其他用药期间的不适反应。

1.6 统计方法

采用PLINK-doc-1.04对患者测序结果进行Hardy-Weinberg遗传基因分布平衡检验。应用SPSS21.0统计软件进行统计分析，各基因亚型组间计量和计数资料差异比较采用t检验和卡方检验。若P<0.05，说明比较具有统计学差异。

2 结果

2.1 研究对象检测指标基线比较见表2。

表2 两组治疗前腰椎、股骨骨密度、PINP、β-CTX基线比较Table 2 Comparison of BMD of the lumbar spine and femur, PINP, and β-CTX between the two groups before the treatment

2.2 治疗前两组基因型分布的比较

据等位基因的实际和理论频数，经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，所有患者ERα基因rs9340799、rs2 234 693位点分布及等位基因频率，见表3。两位点各基因型分布(P均>0.05)，样本具有群体代表性。分析治疗组与对照组ERα基因rs9340799、rs2 234 693位点SNPs各基因型分布发现，两组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 ERα基因rs9340799、rs2 234 693位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验Table 3 Hardy-Weinberg genetic balance test of ERα gene rs9340799 and rs2234693

2.3 治疗后两组骨代谢相关指标变化

治疗6个月发现治疗组腰椎BMD值、T值较治疗前升高(P>0.05)；对照组则均下降(P<0.05)；治疗6个月后，治疗组的腰椎BMD值、T值均明显高于对照组(P<0.05)。治疗组和对照组的股骨BMD值、T值治疗前后比较，无统计学意义；治疗6个月治疗组高于对照组(P<0.05)，见表4。治疗6个月后，腰椎BMD值不变或升高的治疗组为36例，对照组为16例；治疗组下降22例，对照组42例，两组有效率比较(27.59% vs 62.07%)(P<0.001)。治疗6个月后，股骨BMD值不变或升高的治疗组45例，对照组为17例，两组有效率比较(29.31%vs77.59%)(P<0.001)。

表4 治疗6个月后两组腰椎、股骨骨密度的变化Table 4 The changes of BMD of the lumbar spine and femur after 6-month treatment

治疗组骨形成指标PINP在治疗期间呈上升趋势，治疗6个月与治疗前组内比较，差异具有统计学意义(P=0.013)。对照组治疗3个月PINP升高，(P=0.692)；治疗6个月则下降(P=0.806)。治疗6个月治疗组的PINP明显高于对照组(P=0.045)，见图4。治疗组骨重吸收指标β-CTX在治疗3个月、治疗6个月呈下降趋势，对照组β-CTX则出现上升趋势。治疗3个月，2组间比较无统计学差异(P=0.081)；治疗6个月2组间比较，治疗组β-CTX低于对照组，(P<0.001)，见图5。

图4 两组PINP变化趋势图(ng/mL)Fig.4 PINP trend in the wo groups (ng/mL)

图5两组β-CTX变化趋势图(pg/mL)Fig.5 β-CTX trend in the two groups (pg/mL)

2.4 治疗后 ERα基因SNPs与骨密度的关系

统计发现分组情况(group)(P<0.0001)、服药时间(P<0.05)、ERα基因rs9340799位点SNPs(gene1)(P<0.05)、ERα基因rs2234693位点SNPs(gene2)(P<0.05)对患者的腰椎BMD值变化有关。其中A、T纯合型患者治疗前后腰椎BMD值差异，比较无统计学意义(P>0.05)；而G、C等位基因的患者腰椎BMD值治疗后呈下降趋势(P<0.05)，见表5。治疗组各基因亚型的腰椎BMD值均高于对照组(P<0.01)，见表6。ERα基因SNPs与股骨骨密度、PINP与β-CTX治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 安全性评估

观察发现，治疗前后所有患者的血常规、肝肾功能均在正常范围。患者血清雌二醇水平均在绝经后参考范围内，治疗后两组组间比较，均无统计学意义(P>0.05)。两组患者的促卵泡刺激素亦未见明显异常，治疗后两组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 治疗前后ERα基因SNPs各基因型与腰椎BMD值变化Table 5 The change of ERα gene SNPs and lumbar spine BMD before and after the treatment

表6 两组间治疗前后ERα基因SNPs各基因型与腰椎BMD值变化Table 6 Changes of BMD of the lumbar spine for each genotype of ERα gene SNPs before and after the treatment

3 讨论

3.1 ERα基因SNPs与AIBL的关系

乳腺癌术后应用AIs治疗的患者，均为绝经期女性，流行病学调查表明[4]，绝经期女性会出现不同程度的骨代谢异常，这可能与其体内雌激素的缺乏有关。AIs治疗则是通过抑制芳香化酶，减少体内雌激素，从而提高疗效，但同时也破坏了骨吸收和骨形成间的动态平衡，导致骨代谢异常的发生。多项大型临床研究已证实，AIs治疗在带来获益的同时，对骨代谢异常的发生带来较高风险[5]。ATAC[6]及BIG1-98[7]试验已经证实5年AI的疗效明显优于5年TAM治疗。MA.17R研究[8]纳入约2 000例完成5年左右内分泌治疗的激素受体阳性绝经后乳腺癌患者发现AI组中骨折和新发骨质疏松的风险增高。因此如何权衡利弊，防治AIBL的发生尤为重要。

随着研究的深入，单核苷酸多态性(SNPs)检测已作为研究手段被应用到临床及科研中。根据ERα基因1号内含子对ERα的表达与功能的决定性影响，而rs2234693(XbaI A351G)[9]、rs9340799(PvuII T397C)[10]即位于其1号内含子上，且相关研究已证实其与骨质疏松相关。汪曾荣[11]研究结果发现XX(rs9340799)位点多态性对与老年女性髋关节骨质疏松有关。另一项研究[12]则证实，ERα基因位点基因多态性与绝经后妇女骨质疏松症明显相关。既然ERα基因以上两位点SNPs与普通人群中的骨代谢异常有关，而涉及乳腺癌术后应用AI这一特殊人群骨代谢异常的基因多态性研究尚存在空白。故本研究以其为研究对象，结果发现两个位点各基因型及等位基因分布频率与近年国内相关文献类似[3，13]，同时ERα基因rs9340799与rs2234693位点SNPs对腰椎BMD值变化趋势存在影响，C、G等位基因患者的腰椎BMD值在治疗后的下降趋势较纯合型A、T等位基因患者更明显。由此可见，AIs治疗加重了骨代谢异常，其中对纯合型A、T等位基因患者的影响较小，而携带有C、G等位基因的患者更易发生AIBL。

3.2 补肾壮骨方防治芳香化酶抑制剂引起的骨代谢异常临床疗效的关系

目前西医对于骨代谢异常的治疗，主要以补充钙和维生素D为基础。但单纯补充钙和维生素D对骨折等不良反应的发生不能完全预防。因而在治疗中会搭配其他的抗骨质疏松药物，例如双膦酸盐、雌激素替代疗法、选择性雌激素受体调节剂等。但各类药物各有利弊，为治疗带来局限性。在防治骨代谢异常方面，中医药具有一定优势。中医认为，骨代谢异常的发生与“肾、脾、肝”三脏有关。经辨证论治，主以补肾、健脾、疏肝为法。针对AIs治疗的绝经后乳腺癌患者，为肿瘤术后状态，体虚为本；且患者天癸已竭，肾精衰败；同时AIs治疗进一步降低了雌激素水平，加重了“肾虚”。故补肾法在治疗AIBL中尤为重要。本研究充分考虑患者“肾虚”为本的特点，以补肾为根本治法，结合导师临床用药经验及前期研究结果，组方补肾壮骨方，由仙灵脾15 g、补骨脂15 g、骨碎补15 g、菟丝子15 g、淮牛膝30 g组成。其中淫羊藿“味甘气香，性温不寒，能益精气，乃手足阳明、三焦、命门药也，真阳不足者宜之。”故以其为补肾阳之要药。补骨脂其性温味辛，归肾经，具有补肾助阳的作用。骨碎补其性温味苦，归于肝肾两经，主要有补肾强固、续伤止痛的功效。菟丝子性味甘平，归肝、肾、脾经，禀气中和平，善补而不峻，益阴而固阳，乃上品之药。牛膝入肝肾两经，作为引经药，引阳下行温阳补肾。此方补益肾中阴阳，同时引药入经，共凑补肾强骨之用。

研究发现治疗组能增加患者腰椎、股骨BMD，提高血清骨形成指标PINP水平，降低血清骨重吸收指标β-CTX水平，且疗效优于对照组。补肾壮骨方对于各基因亚型均可增加其腰椎BMD值。本研究检测患者治疗前后血常规与肝肾功能均未出现异常，血清雌二醇水平和促卵泡刺激素，治疗前后差异无统计学意义。已有临床研究结果[14]证实补肾中药具有一定抗肿瘤、抗雌激素样作用，并能够安全有效的改善骨代谢[15]。中医药治疗符合中医理论辨证施治，是具有安全性的。

总之，补肾壮骨方能够安全有效地维持骨密度并改善骨代谢异常，对于AIBL具有一定防治作用。ERα基因rs9340799与rs2234693位点中C、G等位基因可能是AIBL的易感基因型，补肾壮骨方可改善AI引起的不良反应，为绝经期乳腺癌患病群体的精准治疗提供依据。研究中患者腰椎BMD和股骨BMD结果存在差异，这可能与不同部位的骨质状况有关，可能还存在测量方法的误差。今后需进一步扩大样本量，对中医药理论补肾中药防治骨代谢异常的机制机理进行探索。