辣椒花药培养消毒技术分析

梁宝萍，赵红星，王 勇，李 艳，姜 俊

（驻马店市蔬菜遗传育种工程技术研究中心·驻马店市农业科学院 河南驻马店 463000）

花药培养技术是把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，改变花粉粒的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织。随后由胚状体直接发育为植株或诱导愈伤组织分化成植株。辣椒花药培养是近年来获得辣椒单倍体的主要途径[1]，关于辣椒的花药培养，早在1973年就获得单倍体植株的报道[2-3]，之后大多数学者对培养基配方及培养方法研究较多[4-7]，并取得了一定的进展。

但是，辣椒花药中普遍存在的问题仍未解决，污染、褐化、玻璃化是阻碍花药培养的三大杀手，相比较而言污染极易发生，污染率达到50%甚至100%，造成大量人力、物力、财力的浪费，是制约辣椒花药培养成功与否的关键因素之一，因此，控制污染成了组培中的首要技术[8]。培养材料的灭菌是植物组培工作中的重要环节，它既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，要求尽可能减少伤害外植体组织和表面细胞[9]。使用时应注意消毒剂的消毒时间。辣椒花药培养中污染控制的研究报道较罕见。高玉蓉等[10]在辣椒污染控制中采用0.01%的HgCl2溶液，消毒液中不必添加吐温的方法减少花药污染率。朱迎春等[11]在对西瓜花药培养时用0.1%HgCl2消毒8 min把污染率降到3.89%，褐化率1.11%，效果最优。张芬兰等[12]在甜椒花药培养抑菌试验分析中用5%NaClO消毒10 min，取得了较好的效果。

笔者通过对文献进行分析和研究实践，对消毒剂和消毒时间进行研究，进而选择针对实验室环境条件的最佳消毒剂和消毒时间，为辣椒花药培养打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料‘驻椒18-5-1-7’，是驻马店市农业科学院自主选育的辣椒自交系材料，于2017年3月15日定植于驻马店市农业科学院试验田温室大棚，该材料具有出胚能力，污染率达90%。由驻马店市农业科学院园艺研究所提供，无菌操作在驻马店市农业科学院实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 取材方法 在盛花期，于晴天日温较低、日照较弱的下午，取无病虫危害、花萼与花瓣近等长的花蕾（此时花粉多为小孢子单核期中后期），取后放入采样盒中带回放入4℃冰箱保存。

1.2.2 灭菌处理 试验材料用具准备、接种过程都进行严格规范操作，最大限度减少人为因素的污染。采集材料处于单核期的花蕾放入无菌的小烧杯中，用75%酒精浸泡30 s，然后依次用5%NaClO、0.1%HgCl2溶液和分别加入吐温20的5%NaClO和0.1%HgCl2溶液灭菌，不断的搅拌消毒液，消毒6、8、10 min共12个处理进行灭菌，如表1。灭菌后取出花药接种于6 mm倒有培养基无菌培养皿中。每个处理接种20皿，每皿接种18枚花药，重复3次。接种完毕后，在33℃培养箱中暗培养3 d，25℃暗培养5 d后统计污染率、褐化率、存活率。公式如下：

表1 花药消毒灭菌处理

污染率/%=（污染的花药数量/接种的花药数量）×100；

褐化率/%=（褐化的花药数量/接种的花药数量）×100；

存活率/%=（存活的花药数量/接种的花药数量）×100。

1.2.3 试验仪器 超净工作台（苏净安泰SW-CJ-2FD），高压灭菌锅（志威GR85DA），光照培养箱（上海左乐PGX-80C）。

1.2.4 数据统计分析 用Excel 2007软件统计分析数据。

2 结果与分析

2.1 不同消毒液消毒效果比较

由图1看出，消毒液不同程度地控制了污染，不同消毒液不同处理时间处理的花药污染率差异均达显著水平。污染率最高的是5%NaClO加0.2%吐温20消毒6 min，平均污染率达66.3%。0.1%HgCl2消毒液消毒10 min平均污染率最低为20.3%，其次为0.1%HgCl2消毒液消毒8 min平均污染率为26.0%。

图1 不同消毒剂不同时间花药平均污染率

2.2 不同消毒液对花药培养的影响

2.2.1 0.1%HgCl2与5%NaClO消毒效果比较 从表2看出，2种不同的消毒液都表现出处理时间越长污染率越低，而褐化率有不同程度的增加。在消毒时间相同时，0.1%HgCl2的消毒花药的污染率明显低于5%NaClO，但褐化率普遍高于5%NaClO。综合来看，0.1%HgCl2溶液消过毒的花药存活率明显高于5%NaClO消毒的花药，0.1%HgCl2溶液的消毒效果好于5%NaClO的消毒液。

2.2.2 加吐温20与不加吐温20消毒液比较 表2显示，用加入0.2%吐温20的5%NaClO消毒，随消毒时间的增加，污染率比不加吐温20低，同时存活率也高。而用0.1%HgCl2溶液消毒，污染率、褐化率、存活率均大于加入吐温20的消毒液。用加入吐温20的0.1%HgCl2溶液消过毒的花药比加入吐温20的5%NaClO的污染率低，存活率高，但褐化率高。

2.2.3 加入吐温的消毒液效果比较 在表2中，两种消毒剂中分别加入0.2%吐温20时，5%NaClO溶液消毒花蕾时随消毒时间的增加污染率减少，存活率升高。用0.1%HgCl2的溶液消毒时，污染率表现出8 min＞10 min＞6 min，没有表现出5%NaClO溶液消毒效果的规律。加入吐温20的5%NaClO在消毒6 min、8 min时花药存活率低于0.1%HgCl2，加入吐温20的5%NaClO的消毒效果在消毒10 min时存活率高于加入吐温的0.1%HgCl2。

表2 不同消毒液对辣椒花药的影响

3 讨论与结论

本次试验研究发现，0.1%HgCl2消毒10 min消毒效果最优，花药存活率最高，消毒液不用加吐温，这与张天翔等[13]和高玉蓉等[10]的结果相同。原玉香等[14]的试验中用0.1%HgCl2消毒6 min，刘广霞等[15]的试验中0.1%HgCl2消毒8 min，张菊平[1]5%NaClO消毒10 min；王忠慧等[16]的试验中5%NaClO消毒8 min，花药存活率较高。这可能和材料、种植地点、接种条件、材料类型有关。

另外，研究表明HgCl2的穿透能力比NaClO强，0.2%吐温20起到表面活性剂的作用，加入吐温20的5%NaClO和0.1%HgCl2随着消毒时间的不同表现各异。在加入吐温20的5%NaClO消毒液中，随着时间的增长，材料存活率比不加吐温20的存活率高，产生这种情况的可能原因是：吐温是表面活性剂，主要作用使消毒液更容易展布，更容易浸入到灭菌材料表面。加入吐温后，随着时间的增加，HgCl2对材料的伤害也在增加，褐化率均大于NaClO。为了降低褐化率，可以适当延长NaClO+吐温20的消毒时间，仍需进一步研究。但在0.1%HgCl2消毒液中加入吐温20时，污染率、褐化率均大于不加吐温20的消毒液，和吐温在NaClO中的规律相反，原因有待研究。

该试验选取的几种消毒液处理主要通过翻阅相关文献和实践经验操作筛选择出，并对2种消毒液中加吐温20进行了扩展，结果具备一定的代表性。不同植物对应的消毒剂、消毒时间都有所差异，辣椒适宜的消毒剂是0.1%HgCl2消毒10 min，外生菌污染率降低，但是内生菌在培养一段时间之后有所显现，还需选择适当的抗生素进行抑菌。