河南省设施保护地蔬菜根结线虫种类调查及鉴定

蔡毓新，唐艳领，史宣杰，杨 凡

（1.河南省庆发种业有限公司 郑州 450002； 2.河南省农业科学院园艺研究所 郑州 450002）

蔬菜根结线虫是一类严重危害黄瓜、番茄、芹菜等蔬菜且具有广泛寄主范围的植物寄生线虫。在我国常见的主要有南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫等4类[1]。每年因蔬菜根结线虫造成的作物减产可达30%～50%，严重时甚至导致绝收[2]。据统计，全球每年因为蔬菜根结线虫病造成的经济损失可达数千亿美元。河南省是中国重要的农业大省，是我国重要的蔬菜生产地区。近年来，由于种植结构的调整，蔬菜的供需量不断增加，使得保护地蔬菜复种指数越来越高，根结线虫危害越来越严重，从而造成蔬菜的产量和品质不断下降。笔者对河南省不同县市的蔬菜保护地区进行采样分析，通过形态鉴别法和PCR分子技术进行根结线虫种类鉴定，旨在明确该地区蔬菜根结线虫的种类和分布，为当地蔬菜根结线虫病的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 线虫危害调查

2016—2017年对河南省主要蔬菜生产产区进行土壤采样和线虫病害调查。土壤采样地点主要有新乡市、周口市、安阳市、驻马店市等17个地区。采样点、寄主、设施类型、种植年限等具体见表1。按照随机取样的方法，根据地块大小，采用5点法，每点选取5株蔬菜进行分析，计算根结指数。

病情分级标准：0级：根系无根结；1级：根系1%～5%有根结；2级：根系6%～20%有根结；3级：根系21%～40%有根结；4级：根系41%～70%有根结；5级：根系71%以上有根结。

根结指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100。

表1 河南省主要蔬菜保护地根结线虫的采集信息

1.2 线虫分离鉴定

采用改良贝曼漏斗法对根际土壤进行线虫分离。根样需要先剪碎研磨，解剖植物根部进行分离线虫或卵块。将分离的成熟雌虫置于载玻片上，用手术刀切下包含完整的会阴花纹角质膜，加盖玻片于显微镜下观察会阴花纹的形态特征。

1.3 线虫DNA提取

从根结分离得到单条成熟雌虫，置于单个PCR管中且-20℃冷冻保存。取出冷冻保存的装有雌虫的 PCR 管，加入 10×Buffer PCR 3 μL，600 μg·mL-1蛋白酶K 3 μL；振荡使雌虫虫体破碎，混合；加入14 μL ddH2O，将整个体系补足至 20 μL；放入-20 ℃冰箱中处理10 min；65℃下温育1.5 h后，95℃下处理 10 min；取处理好的提取液，13 000 r·min-1离心2 min；取上清液于另一个PCR管中。获得单个线虫的DNA，-20℃保存备用。

1.4 线虫DNA检测

利用线虫通用引物D2A、D3B扩增各个线虫28SrDNA-D2/D3区片段，引物序列如表2所示：

表2 扩增线虫28S rDNA-D2/D3区片段通用引物序列

PCR扩增程序为：94℃ 5 min，94℃ 50 s、50℃ 1 min、72℃ 2 min、30个循环，72℃ 10 min。PCR扩增总体系如表3所示。

电泳检测PCR扩增产物：扩增完成后，取5 μL扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压110 V，电流110 mA，30 min。EB染色，EP凝胶成像系统观测，并拍照记录。

表3 PCR反应体系

1.5 PCR分子鉴定

PCR扩增线虫特异性片段：采用4对不同的特异性引物MI-F/MI-R（南方根结线虫），Mh-F/Mh-R（北方根结线虫），Fjav/Rjav（爪哇根结线虫），Far/Rar（花生根结线虫）对线虫的特异性片段进行PCR扩增，4对引物的序列分别为如表4所示，扩增体系见表5。

表4 线虫特异性引物序列

PCR扩增程序为：（1）南方根结线虫：94℃2 min，94℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72℃ 1 min、45 个循环，72℃7 min；（2）爪哇根结线虫：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、45 个循环，72 ℃ 7 min；（3）北方根结线虫94℃ 2 min，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃1 min、45个循环，72℃7 min；（4）花生根结线虫 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、45个循环，72℃7 min。

电泳检测PCR扩增产物：扩增完成后，取5 μL扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳。EB染色，凝胶成像系统观测。

表5 PCR反应体系

1.6 南方根结线虫生理小种鉴定

用鉴别寄主试验方法鉴定南方根结线虫的小种。按照Taylor等所采用的烟草（NC.95）、棉花（Deltapine16）、辣椒（California Wonder）、西瓜（Charleston Grey）、花生（Florrunner）和番茄（Rutgers）6 个鉴别寄主上的表现，主要区别在对烟草（NC.95）、棉花（Deltapine16）2个寄主的感染性不同（表6）。

表6 南方根结线虫生理小种在棉花和烟草寄主上的寄生情况

首先将烟草（NC.95）、棉花（Deltapine16）穴盘育苗，穴内装有灭菌的草炭土∶蛭石=1∶1(体积比)，出苗30 d后移栽到装有灭菌的沙∶土=2∶1的小盆中，盆深10 cm，盆上口直径15 cm，装沙土1 100 g，移栽1周后接种线虫，每盆保苗1株。所有寄主接种根结线虫的量均为5 000个卵/盆，接种45 d扣盆调查每株根系上根结数量，每20盆为1个处理，3次重复。根结的分级标准为：无根结的为0级；1～2个根结的为1级；3～10个根结的为2级；11～30个根结的为3级；31～100个根结的为4级，100个以上的根结为5级。0、1级为不亲和，用“－”表示；2～5级为亲和，用“+”表示。根据线虫在上述寄主上的表现确定南方根结线虫的小种。

2 结果与分析

2.1 根结线虫危害性

调查结果表明，新乡、驻马店等地区黄瓜、番茄等蔬菜受根结线虫的危害严重，被调查菜田的株发病率均在50%以上，其中新乡市牧野区段庄地区黄瓜、番茄植株发病率高达85%以上，根结指数达到47.3以上，同时还伴有枯萎病、青枯病及细菌性流胶病等病害的复合发生；驻马店上蔡黄埠镇地区甜瓜植株发病率高达93%，根结指数达到49.8（图1，表7）。经过调查分析发现，该地区根结线虫病害严重主要和施用未腐熟的鸡粪有关，从外地引进的根结线虫卵和幼虫。同时发现，根结线虫病害发生的严重程度与保护地种植年限密切相关，年限越长，根结线虫的病害越严重。老棚区根结指数明显大于新棚区。这可能是由于保护地内高温高湿的环境条件，加上作物复种指数高，连作栽培普遍，造成蔬菜根结线虫病呈逐年加重趋势。

图1 黄瓜根结线虫（A）和番茄根结线虫（B）危害情况

表7 河南省主要蔬菜保护地根结线虫危害调查结果

2.2 根结线虫形态学鉴定

对雌虫会阴花纹进行显微镜观察，发现雌虫会阴花纹呈椭圆形，背弓高，背弓顶部圆平，背纹紧密；花纹背面和侧面的线纹呈波浪形或锯齿状，侧线不明显等特征，初步认为寄生黄瓜和番茄的根结线虫种类主要是南方根结线虫（图2）。

图2 南方根结线虫会阴花纹

2.3 线虫分子鉴定

根据对线虫D2A-D3B区域进行PCR扩增，只有采用特异性引物MI-F/MI-R扩增，才有特异性条带产生，片段大小为990 bp（图3）。

图3 PCR扩增结果

2.4 南方根结线虫生理小种鉴定

调查结果发现，烟草、棉花除了个别处理的植株有1～2个根结外，发病程度很低，各处理之间无显著差异，和黄瓜或番茄等蔬菜的发病程度及根结指数有显著性差异。根据南方根结线虫在烟草、棉花和番茄上的寄生情况和反应表型，本次调查的根结线虫种群属于南方根结线虫1号小种。

3 讨论与结论

笔者调查了河南省17个地区的设施保护地内番茄、黄瓜、甜瓜的主要根结线虫种群，采集的线虫样本经分离后进行DNA提取检测，用形态学鉴定法和鉴别寄主试验方法对根结线虫进行鉴定。试验结果表明，侵染河南省设施保护地内番茄、黄瓜、甜瓜的主要根结线虫种群属于南方根结线虫1号小种。

对根结线虫进行研究和防治的基础是种类鉴定。笔者本次调查采集的地点主要在保护地，温湿度大，良好的气候条件为南方根结线虫繁殖提供了环境基础。保护地常年种植蔬菜，复种指数高，也加重了根结线虫发生的危害[3]。南方根结线虫有1号、2号、3号和4号小种，其中1号为优势小种[4]。李春杰等[5]在对黑龙江省大庆市蔬菜根结线虫调查时也发现，大棚内感染番茄和黄瓜的南方根结线虫是1号小种，姚玉荣等[6]对危害天津6个主要温室蔬菜产区的根线线虫进行种类鉴定，也发现全部为南方根结线虫。本试验结论与前人研究结论相符。

近年来，随着分子生物学的发展，运用PCR技术结合传统形态学分类及同工酶分析等方法，能够快速、准确地鉴定根结线虫的种类，而且鉴定结果准确可靠[7]。笔者通过形态学和分子生物学方法相结合，进一步证实了河南省17个县市设施保护地根结线虫为南方根结线虫1号小种，确定出了优势种群。在这次调查中并未发现根结线虫合并侵染的情况，可能由于采集的地区不全面，样本不丰富，在以后的工作中需要不间断定时监测，对河南省保护地蔬菜根结线虫病害选育抗病品种有重要意义，同时为根结线虫病害的防治工作提供科学依据。