不同植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中N-亚硝胺含量影响

武思敏，黄莉，2*，任晓云，刘俊丽，王兴瑞，闫瑾，张丹，张丛丛

1(滨州学院 生物与环境工程学院，山东 滨州，256600) 2(山省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州，256600) 3(滨州出入境检验检疫局技术中心，山东 滨州，256600)

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

选择50只14日龄白羽肉鸡，分成5组，每组10只，饲喂于山东绿都生物科技有限公司。从第21天～第42天在饲料中分别添加200 mg/kg VE(纯度98%)、110 mg/kg绿原酸和儿茶素(纯度90%)、167 mg/kg鼠尾草酸(纯度60%)，分别为VE组、绿原酸组(chlorogenic acid，CHA)、儿茶素组(catechin，CAT)、鼠尾草酸组(carnosic acid, CAR)和空白组(control)。在第43天将肉鸡宰杀后取鸡胸肉和鸡腿肉，用保温箱加冰块运回实验室，放在冰箱冷藏24 h开始制样；食盐、十三香均购于滨州市全福元超市；复合磷酸盐、亚硝酸钠购于滨州市霞光食品添加剂有限公司。

1.1.2 试剂与设备

儿茶素(EGCG)、鼠尾草酸、绿原酸、VE，南京道斯夫生物科技有限公司；2,4-二硝基苯肼、盐酸胍等试剂为生化试剂，二氯甲烷等为分析纯，均购于滨州市泰达试剂商贸公司；N-甲基亚硝胺、N-乙基亚硝胺标准品，上海安谱实验科技股份有限公司。亚硝酸盐试剂盒，南京建成悦浩科技有限公司。

DZ-600/2S型真空包装机,诸城市天顺机械有限公司；FJ200-SH数显分散均质机,上海标本模型厂；SM-G73绞肉机,广州新域机电制造有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司；低温离心机,赛默飞世尔科技中国有限公司；雷磁PHS-3C pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司；气相色谱—质谱联用仪(Agilent 7890A-5975C)，美国安捷伦科技有限公司；旋转蒸发仪,上海爱明仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

取解僵后的鸡胸肉(870 g)、鸡腿肉(435 g)、鸡脂(145 g，添加比例为鸡肉的10%)使用绞肉机绞碎，粒度直径为 5.6 mm，复合磷酸盐(4.35 g)、十三香粉(11.6 g)、亚硝酸钠(0.195 7 g)、食盐(29 g)，拌成肉馅并制成肉饼，立即装袋后进行真空包装，于 4℃冰箱中冷藏。

1.2.2 基本成分测定

蛋白质含量测定参照国标GB 5009.5—2016测定，取样量为0.50 g。水分含量测定采用水分测定仪，准确称取1.00 g鸡肉饼，在105 ℃将其烘干至恒重。脂肪含量：参照国标GB/T 5009.6—2003，将样品干燥后采用石油醚索氏抽提。灰分含量：参照国标GB 5009.4—2016，取样量为1.00 g。

1.2.3 羰基值的测定

取1.00 g鸡肉饼，加入10 mL 20 mmol/L PBS(pH 6.5，内含6 mol/L NaCl)于50 mL离心管中，高速均质30 s，分别取4等份0.2 mL均质液于10 mL离心管中，每管分别加入1 mL 10% TCA，并于4 200×g离心5 min，用以沉淀蛋白。测定羰基的步骤与XIA[10]的方法相同。羰基蛋白浓度测定采用紫外分光光度法，标准曲线为y=0.584 7x-0.001 3(R2=0.999 3)。羰基值用nmol/mg蛋白表示，计算公式如下：

(1)

其中：C蛋白浓度,测定用样液蛋白质量浓度,mg/mL；22 000，羰基的摩尔吸光系数。

1.2.4 TBARS值的测定

参照SINNHUBER和YU[11]的方法，并作适当的修改。取2.00 g鸡肉饼于15 mL带塞离心管中，加入1.5 mL TBA以及7.5 mL三氯乙酸-盐酸溶液，充分振荡待混匀后于100 ℃水浴30 min，待其冷却后，取出4.5 mL样液，并加入4.5 mL三氯甲烷，于1 000×g离心10 min，离心后再次振荡混匀，相同条件下再次离心，在532 nm处比色，使用三氯乙酸-盐酸溶液调零，读取吸光值。计算公式如下：

(2)

其中：m,测定所需鸡肉饼质量,g；Abs532,测定样液吸光值；9.48,常数。

1.2.5 pH的测定

取5.00 g鸡肉饼，加入45.0 mL蒸馏水，使用均质机高速匀浆，测定匀浆液的pH值。

1.2.6 保水性的测定

根据LIU等[12]的方法并稍作修改。取5.00 g鸡肉饼样品(m0)，置于50 mL离心管中，于4 ℃ 2 000×g离心20 min。准确称取离心后肉样质量(m1)。另取1.000g鸡肉饼肉样于水分测定仪中(m2)，在105 ℃下干燥直至恒重(m3)。计算公式如下：

(3)

其中：m0,鸡肉饼离心前的质量，g；m1,鸡肉饼离心后的质量，g；m2,鸡肉饼干燥前的质量，g；m3,鸡肉饼干燥后的质量，g。

1.2.7 亚硝酸盐残留量的测定

参照GB 5009.26—2016，称取5.00 g鸡肉饼，加入10 mL蒸馏水，经高速匀浆制成匀浆液，取0.4 mL于10 mL离心管中，取两只空管，一只为空白管，另一只为标准管，每管分别加入0.4 mL蒸馏水、0.4 mL 100 μmol/L 亚硝酸钠。随后，每管分别加入0.8 mL 1号试剂、0.4 mL 2号试剂，混匀后放置10 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液0.8 mL用以显色。每组加入显色剂0.4 mL，混匀，于15 min后在550 nm处用0.5 cm比色杯比色，蒸馏水调零。计算公式如下：

(4)

式中：C[标准品]，标准品浓度，100 μmol/L;n,样品稀释倍数。

1.2.8N-亚硝胺含量的测定

参照国标GB/T 5009.26—2003测定，取样量为200.00 g。分析条件：载气： 氦气，纯度大于等于99.999%； 流速：1.0 mL/min；色谱柱 DB-5MS(30 m×0.25 mm)；进样方式：不分流进样；进样体积：1.0 μL；进样口温度：250 ℃；程序升温条件：70 ℃保持5 min,再从20 ℃升到240 ℃。

1.3 数据统计分析

每个试验重复3次，结果表示为平均数±SD。数据统计分析采用Statistix 8.1 (分析软件, St Paul, MN) 软件包中Linear Models程序进行，差异显著性(p<0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 11.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 植物多酚对鸡肉的基本成分的影响

由表1可以看出，日粮添加植物多酚对鸡肉(饼)中蛋白质、脂肪及灰分的含量均没有显著影响，鸡肉饼中的蛋白质含量为16%～17%，粗脂肪含量为9.5%～10%之间，灰分含量为5.2%～5.6%。总体上看儿茶素组蛋白质和脂肪含量偏低，鼠尾草酸组含量偏高一点。因各组中配方及所添加辅料均是相同的，所以各组鸡肉饼成分的差别应来源于鸡肉。据报道，茶多酚(儿茶素)可以提高动物的生长性能[13]，但对鸡肉基本成分的影响未见报道，这可能与植物多酚在动物体内的代谢有关，还需进一步探讨。

表1 鸡肉饼基本成分Table 1 Proximate composite of chicken pie

注：具有相同的字母(A)表示日粮添加不同的植物多酚的鸡肉基本成分差异不显著 (p>0.05)。

2.2 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中抗氧化作用影响

TBARS值可表征鸡肉饼在冷藏过程中的脂肪氧化程度，羰基值可表征其蛋白氧化程度。由图1可以看出，鸡肉饼在冷藏过程中发生了明显的脂肪氧化，TBARS值整体上呈现快速增加的趋势，羰基值也呈现出后期快速增加的趋势。鸡肉饼的初始TBARS在0.016～0.058 9 mg/kg，富含植物多酚的鸡肉饼在冷藏过程中均表现出一定的抗氧化效果，抗氧化能力大小依次为：鼠尾草酸>儿茶素>VE>绿原酸。这与毕田田等[14]在研究鼠尾草酸LDPE活性膜对新鲜鸡肉丸品质特性中的结果一致。贾娜等[15]在鸡肉糜中添加迷迭香提取物(鼠尾草酸是迷迭香提取物的主要成分)，也证实迷迭香提取物能够显著地抑制鸡肉糜的脂肪氧化。同样地，鸡肉饼的初始羰基值在0.82～1.41 nmol/mg，鸡肉饼中的羰基含量在冷藏的前7 d没有明显的变化(p>0.05)，但随着冷藏时间的延长，羰基含量开始快速增加并达到最大值。与对脂肪氧化抑制的效果相似，鼠尾草酸的抗氧化能力最强，其次是儿茶素和VE，绿原酸再次之。曹云刚[16]也证实植物多酚对蛋白氧化的抑制效果与对脂肪氧化抑制效果呈正相关。醛类是脂肪氧化的主产物，是蛋白羰基共价结合的一个重要来源产物的前体物。因此，植物多酚对鸡肉饼的蛋白氧化和脂肪氧化抑制作用具有一致性。

图1 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中TBARS和羰基值的影响Fig.1 Effect of plant polyphonel on TBARS and carbonyl content of chicken pie during the refrigeration注：具有不同的字母(A～E)表示添加相同的植物多酚的鸡肉饼在不同冷藏时间内差异显著 (p<0.05)；具有不同的字母(a～b)表示添加不同植物多酚的样品在相同冷藏时间内差异显著 (p<0.05)，下同。

2.3 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中pH值的影响

由图2可以看出，鸡肉饼的最初 pH值为6.40左右，在鸡肉饼的冷藏过程中，pH值呈先上升后下降整体趋势，与梁慧对三黄鸡肉的pH值变化趋势基本相同[17]。最初阶段pH 值升高可能是由于蛋白被降解产生非蛋白态氮导致；pH值下降可能是由于乳酸菌开始繁殖，导致鸡肉饼pH逐渐下降。从第3天开始，pH值逐渐上升，直到第7天pH值达到又一个峰值，这可能与肉制品本身的作用和配料的添加有关；第7天以后pH继续下降，这可能是因为随着冷藏时间的延长，鸡肉饼中的微生物不断繁殖，鸡肉中的蛋白质、脂肪被微生物分解，产生酸性物质，导致鸡肉饼中的pH值不断降低。VE组下降幅度与富含3种多酚的鸡肉饼有较大差异，此时，与空白对照组相比，含有绿原酸和鼠尾草酸的鸡肉饼pH略低，而含有儿茶素的鸡肉饼pH略高，这可能与儿茶素的抑菌作用较强有关，本研究中使用的是酯型儿茶素(EGCG)，对细菌的抑制作用较强，具有广谱性和高效性[18]。

图2 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中pH值的影响Fig.2 Effect of plant polyphonel on pH of chicken pie during the refrigeration

2.4 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中保水性的影响

由图3可以看出，鸡肉饼的保水性在整个冷藏过程中呈下降趋势，由最初的82.26%～85.49%下降至第21天的66.55%～78.14%，冷藏时间对鸡肉饼的影响很显著(p<0.05)，但植物多酚对鸡肉饼的影响不显著(p>0.05)。经过21 d的贮藏，空白对照组、儿茶素组以及绿原酸组的保水性降至65%左右，而VE组和鼠尾草酸组的保水性较为稳定，维持在80%左右。这可能与鼠尾草酸、VE能有效抑制蛋白氧化、脂肪氧化过程有关。高海燕等的研究表明，VE对保水性的影响可能机制是阻止了鸡肉饼冷藏期间的膜磷脂氧化，从而达到保持细胞膜完整性，抑制胞浆液穿过细胞膜发生流失[19]。

图3 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中保水性的影响Fig.3 Effect of plant polyphonel on water holding capacity of chicken pie during the refrigeration

2.5 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中亚硝酸盐残留量及亚硝胺含量的影响

由图4可以看出，亚硝酸盐的残留量随着冷藏时间的延长呈现先增加后减少的趋势，但在贮藏后期，多酚组中亚硝酸盐残留量明显高于VE组和空白对照组，这个结果与直接向肉制品中添加植物多酚的结果是恰好相反的。亚硝酸盐在酸性环境中生成亚硝酐，亚硝酐可与氨基酸和胺类物质生成亚硝胺[2]，这可能是各组样品中的亚硝酸盐含量随着时间延长而下降的一个原因。

图4 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中亚硝酸盐残留量的影响Fig.4 Effect of plant polyphonel on nitrate residue of chicken pie during the refrigeration

一些研究表明植物多酚对亚硝酸盐具有清除能力[20]，将植物多酚直接加入肉制品中，如魏延玲等直接将阿魏酸添加到腌制的鲈鱼中，研究其在风干及贮藏过程中亚硝酸盐残留量的影响，结果发现阿魏酸能降低亚硝酸盐的残留量[21]。魏萌将蓝莓打浆后加入蒸煮火腿中，发现不同品种、产地的蓝莓对亚硝酸盐的抑制率在6.27%～38.11%[22]。本实验的结果也可能是由于多酚极性不同，经过鸡消化吸收后已经转变成其他物质或者排出体外，所以对亚硝酸盐未表现出消除能力，这点还需要进一步探讨。

2.6 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中亚硝胺含量影响

本研究共探讨了植物多酚对鸡肉饼中NDMA和NDEA两种亚硝胺含量的影响，如表2所示，所有的样品在第0天均未检出NDMA和NDEA，而从第7天到第21天，各组样品中NDMA和NDEA含量均呈明显增加趋势，但均未超过国标限定值(3 μg/kg)。当冷藏至第21天时，对照组中NDMA含量明显高于多酚组(p<0.05)，且儿茶素组NDMA含量最低；与对照组相比较，VE组、绿原酸组、儿茶素组和鼠尾草酸组的NDMA的含量分别下降了10.74%、0.38%、28.34%和6.64%。NDEA组具有与NDMA相同的趋势，冷藏至21 d时，与对照样相比，VE组、绿原酸组、儿茶素组和鼠尾草酸组的NDEA含量分别下降了9.36%、18.88%、20.02%和12.94%。

表2 植物多酚对鸡肉饼冷藏过程中N-亚硝胺生成量的影响 单位：μg/kg

注： “ND”未检出。具有不同字母(A～C)表示添加相同得植物多酚的鸡肉饼在不同冷藏时间内差异显著(p<0.05);具有不同的字母(a～e)表示添加不同植物多酚的样品在相同冷藏时间内差异显著(p<0.05)。

肉制品中N-亚硝胺的产生和含量受许多因素的影响，包括添加的亚硝酸盐浓度以及亚硝酸盐残留量，N-亚硝胺前体的浓度，贮藏时间等。鸡肉饼冷藏过程中NDMA和NDEA的生成可能是因为鸡肉饼中蛋白质氧化产生的胺类物质特别是仲胺与亚硝酸盐生成的亚硝酸酐之间的化学反应[23-24]。鸡肉饼中含有约10%的脂肪，它会促进鸡肉饼的氧化，也导致鸡肉饼在冷藏过程中N-亚硝胺含量增加的一个原因，熊凤姣等研究发现加工过程中添加肥膘可以显著增加鱼豆腐的NDEA的含量[25]。在多酚组中，儿茶素组的NDMA含量最低，其他多酚组的N-亚硝胺的含量也明显低于对照组，这说明植物多酚可能是通过抑制N-亚硝胺的前体物质的生成来阻断N-亚硝胺的生成途经的。YANG等认为蛋白氧化会促进亚硝化作用，导致猪肉背部最长肌在冷藏过程中NDEA含量增加[26]。生物胺也是形成N-亚硝基化合物的重要前体物质，可以参与亚硝化反应，鸡肉饼在冷藏过程中因微生物的作用可以生成腐胺、尸胺等化合物，为亚硝胺的生成提供了前体物质。在本研究中，儿茶素具有较强的抑菌能力，鼠尾草酸具有较强的抗氧化能力，而儿茶素比鼠尾草酸表现出更强的对N-亚硝胺的阻断作用，说明在鸡肉饼冷藏过程中，微生物引起的腐败作用形成的生物胺类物质要多于蛋白氧化生成的胺类物质，促进了N-亚硝胺的生成。此外，儿茶素(极性较强)，鼠尾草酸具有强亲脂性(极性较弱)，经过消化系统后所表现出的对肉中N-亚硝胺的抑制作用需进一步探讨。

3 结论

在鸡的日粮中添加绿原酸、鼠尾草酸以及儿茶素，均可抑制鸡肉饼在冷藏过程中的脂肪氧化和蛋白氧化，鼠尾草酸对鸡肉饼的TBARS值和蛋白氧化抑制作用较强，但对于保水性的作用不显著；日粮添加植物多酚并未减少亚硝酸盐的残留量，但对鸡肉饼中N-亚硝胺的生成有一定的阻断作用，添加100 mg/kg的鼠尾草酸、绿原酸、儿茶素，可使NDMA生成量下降0.38%、28.34%和6.64%；使NDEA生成量下降18.88%、20.02%和12.94%。因此，在动物日粮中添加绿原酸、儿茶素等植物多酚有助于抑制肉制品的氧化作用，有利于降低肉制品中N-亚硝胺的生成量。此研究对提高我国肉类产品的质量与安全具有一定意义。