稀有人参皂苷对实验性白癜风模型的影响

吴苑琪,刘魏征,范丽华,朱晨辉,段志广,范代娣

(西北大学 化工学院, 陕西 西安 710069;2.同济大学 生命科学与技术学院，上海 200092)

白癜风是以皮肤黑色素细胞功能缺失为特征的获得性皮肤病,多表现为局限性或泛发性的皮肤黏膜色素脱失[1]。该病普遍认为是由于遗传免疫、神经精神、内分泌代谢、环境及自由基的氧化损伤等多方面因素引起黑素细胞的破坏,从而导致色素脱失[2-3]。

人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3是从人参中提取出的一类有效成分,具有抗肿瘤、抗疲劳、增强免疫力等作用[5],能在一定程度上增强黑素细胞的活性。目前,在国内报道过用白蒺藜、补骨脂等为主的中草药治疗白癜风[6],但至今尚未见有关于稀有人参皂苷组合物对白癜风治疗的研究报告。因此本实验通过MTT实验研究人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物对体外黑素瘤细胞的抑制作用以及通过对实验性豚鼠进行氢醌及过氧化氢脱色,对比研究人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物对白癜风动物模型的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂

人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3:本实验室自制(纯度90%);RPMI-1640细胞培养基:Gibco公司;MTT:北京索来宝公司;DMSO:Sigma公司;氢醌:天津市天力化学试剂有限公司;过氧化氢:西安化学试剂厂;硫化钠:天津市天力化学试剂有限公司;血清酪氨酸酶(TYR)试剂盒、胆碱酯酶(CHE)试剂盒、单胺氧化酶(MAO)试剂盒:上海圻明生物科技有限公司。

1.2 细胞与动物

黑素瘤细胞B16-F10,购买于中国科学院细胞库;花黑色豚鼠60只,体重180g～200g,购自第四军医大学动物实验中心。

1.3 仪 器

80i正置显微镜，日本Nikon公司;多功能酶标仪，美国BioTek公司;电热鼓风干燥箱，武汉海声达仪器设备公司;台式离心机，上海医疗器械厂;超低温冰箱ULT1386-3-V34，美国REVCO;真空冷冻干燥机FREEZONE，美国LABCONCO;电子天平，瑞士MettlerTolledo公司。

1.4 MTT实验

1.4.1 细胞培养和细胞增殖活性测定 取对数生长期的黑素瘤B16-F10细胞, 经计数板计数、 1 640培养液稀释,将其制备成密度为1.0×105个/mL的细胞悬液,将其接种于96孔板中,每孔100 μL(细胞密度约为每孔1.0×104个)。 培养24h后, 吸出原培养液, 加入终浓度为 62.5， 125， 250， 500μg/mL的人参皂苷组合物(人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物质量比分别为m(Rh2)∶m(Rg3)=2∶8;m(Rh2)∶m(Rg3)=5∶5;m(Rh2)∶m(Rg3)=8∶2)。每一浓度设6个复孔,以含0.5% DMSO的1 640培养液作为阴性对照[7-9]。待48h后,用微量加样枪吸出药液。然后每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL,继续培养4 h,吸出原培养液,每孔加入150 μLDMSO,在室温下振荡10 min后,用酶标检测仪在波长为A570下进行测定其吸光度值(OD)。

1.4.2 评价方法 按以下公式计算人参皂苷组合物对黑素瘤细胞增殖抑制率。

抑制率(%)=(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100%。

1.5 动物模型实验

1.5.1 豚鼠白癜风模型的建立与给药 取黑色或黑花色豚鼠60只,雌雄各半,选择豚鼠背部黑灰色部位,4cm×4cm为单位作为试验区。随机分为空白对照组、模型对照组、高剂量组(2.0g/kg)和低剂量组(1.0g/kg),每组10只。除空白对照组外,在剩余50只豚鼠中随机挑选25只在皮肤试验区涂抹5%过氧化氢,另外25只涂抹7%氢醌,每次用量约1mL,每天1次,连续30d进行建模。空白对照组每天涂抹等量纯化水[10]。

待建模成功后,剂量组给予含1.0g/kg和2.0g/kg的人参皂苷组合物(人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3按照体积比5∶5混合)的鼠粮,空白对照组和模型对照组给予等量不加药的鼠粮,持续40天。

1.5.2 肉眼观察 每天按时观察豚鼠的活动、进食、精神状态和建模情况。每隔5d称重1次,定期对动物试验区皮肤进行观察、拍照。建模成功后,肉眼观察人参皂苷组合物对白癜风豚鼠模型的治疗效果,并记录其色素脱失情况。

模型成功标准:肉眼可观察到豚鼠黑色皮肤变苍白,随着用药时间的延长,有的出现白斑,甚至原有黑毛处长出白毛[11]。

疗效判定标准:以豚鼠用药部位中心3cm2为一观察单位,以空白对照组皮肤颜色为参照,优为受试区皮肤呈黑色;良为受试区皮肤呈棕黑色或棕色;中为受试区皮肤呈棕黄色;差为受试区皮肤呈黄色或白色;总有效率以优加良计算[12-13]。

1.5.3 生化测定 将豚鼠于末次给药后1 h,以20%乌拉坦腹注射麻醉(0.5 mL/100 g),于腹部主动脉取血,按照各试剂盒的说明书加入到抗凝管中,离心得到血浆,用于单胺氧化酶(MAO)、胆碱酯酶(CHE)、血清酪氨酸酶(TYR)等指标的检测。

2 结 果

2.1 对细胞增殖的抑制作用

将人参皂苷Rh2与人参皂苷Rg3按照一定的质量比(分别为2∶8，5∶5，8∶2)混合,配制终浓度为 62.5，125，250，500μg/mL的人参皂苷组合物,并与相同浓度的两种皂苷Rh2和Rg3作为对照,作用于黑素瘤细胞B16-F10。比较3种不同比例人参皂苷Rh2，Rg3组合物对黑素瘤细胞的抑制作用。结果如图1，2和3。

与对照组相比,不同浓度的人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物、人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3对黑素瘤细胞的增殖均有抑制作用。并且，人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物较人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3对黑素瘤细胞增殖的抑制作用更加显著。其中,人参皂苷Rh2与人参皂苷Rg3以质量比2∶8混合对黑素瘤细胞增殖的抑制率达到60%以上;人参皂苷Rh2与人参皂苷Rg3以质量比5∶5混合黑素瘤细胞增殖的抑制率达到67%以上;人参皂苷Rh2与人参皂苷Rg3以质量比8∶2混合黑素瘤细胞增殖的抑制率达到65%以上。

2.2 豚鼠白癜风模型实验结果

2.2.1 白癜风模型建立 7%(质量分数)氢醌建模30天后试验区出现明显白斑白毛,在有些白斑周围皮肤光滑,无法长出毛发。实验区其余部分毛发呈灰色,与空白对照组试验区的黑色毛发有明显差别。肉眼观察5%(体积分数)过氧化氢模型,豚鼠皮肤表现苍白并长出白毛,与空白对照组试验区的黑色毛发有所差别。但是皮肤表面局部溃烂,与7%(质量分数)氢醌模型相比较不利于观察。

图1 人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物质量比2∶8时对黑素瘤细胞增殖的抑制率Fig.1 The inhibition rate of ginsenosides Rh2 and ginsenosides Rg3 composition when the proportion of 2∶8 to melanoma cells proliferation

图2 人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物质量比5∶5时对黑素瘤细胞增殖的抑制率Fig.2 The inhibition rate of ginsenosides Rh2 and ginsenosides Rg3 composition when the proportion of 5∶5 to melanoma cells proliferation

图3 人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物质量比8∶2时对黑素瘤细胞增殖的抑制率Fig.3 The inhibition rate of ginsenosides Rh2 and ginsenosides Rg3 composition when the proportion of 8∶2 to melanoma cells proliferation

2.2.2 人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物治疗豚鼠模型效果评估 人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物治疗白癜风豚鼠模型的效果观察见表1。

2.2.3 人参皂苷组合物对豚鼠血浆中MAO，CHE，TYR指标的影响 由表2可见,模型对照组豚鼠血浆中的MAO，CHE活力明显增加,TYR活力明显降低,与空白对照组比较,差异显著。用药后,实验组豚鼠血浆中MAO，CHE活力明显降低,TYR活力明显增加,与模型对照组比较,差异显著。结果表明,人参皂苷组合物能够明显降低白癜风豚鼠模型血清中MAO，CHE的活力,增加TYR的活力。

表1 人参皂苷组合物对白癜风豚鼠模型的疗效评定情况(n=10)Tab.1 Therapeutic effect evaluation situation of ginsenoside combination on guinea-pig model of vitiligo (n=10)

注:与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

表2 人参皂苷组合物对豚鼠血浆中MAO，CHE，MDA指标的影响Tab.2 The effects of rare ginsenoside composition on the indexes of MAO, CHE and MDA in guineapig plasma

注:与正常组比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

3 讨 论

实验早期我们用体外培养鼠黑素瘤细胞B16-F10,观察不同浓度、不同比例的人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的组合物、人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3对其生长的抑制率。通过实验发现,不同浓度、不同比例的人参皂苷对黑素瘤细胞有不同的抑制率,当人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的组合物以质量比5∶5混合且终浓度大于125μg/mL时,对黑素瘤细胞B16-F10的抑制率达到67%以上。由此证明，人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物可以抑制黑素瘤细胞增殖且效果显著。并根据体外细胞毒实验结果确定以质量比为5∶5的人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物进行白癜风动物模型实验。

根据黑色素易受强氧化剂破坏的特点,本实验使用5%(体积分数)过氧化氢以及7%(质量分数)氢醌制备白癜风动物模型,通过对比发现使用7%(质量分数)氢醌制备的动物模型模拟效果较好,这可能是由于过氧化氢与氢醌的脱色机制不同引起的。过氧化氢溶液中的HO2-离子能破坏色素的共轭双键,是起到漂白作用的重要成分,目前无法得知过氧化氢能否对酪氨酸活性和黑色素的生成产生影响。而氢醌能够抑制酪氨酸酶的生成,从而影响黑色素的合成[15-16]。因此本文认为过氧化氢只是对已经生成的黑色素具有漂白作用,并不影响黑色素细胞生成黑色素;而氢醌能够降低细胞生成黑色素的能力,在短时间内造成白癜风样皮肤改变。

实验组豚鼠模型的皮肤上有大部分黑色素缺失,肉眼可观察到动物皮肤均明显变白,有的地方出现白斑且长出灰白色毛发。该模型在一定程度上能够反映白癜风的主要病理特征,证明本实验模型是成功的。通过喂食不同浓度人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的组合物后,相较于模型对照组,实验组的白癜风症状明显减退,白斑白毛逐渐减少,且高剂量皂苷组合物的作用效果比低剂量皂苷组合物的作用效果更好。

4 结 论

本实验通过体外细胞毒实验研究不同浓度、不同比例的人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物、人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3对黑素瘤细胞 B16-F10的抑制率以及构建动物模型实验研究不同计量的人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的组合物对白癜风动物模型的治疗效果表明,该药能在体外抑制黑素瘤细胞B16-F10的增长,能在白癜风动物模型中能减轻白癜风症状。人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物能使白癜风豚鼠模型血浆中的MAO值降低,CHE活力降低,TYR含量增加,说明人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3组合物能明显改善白癜风的病变,对白癜风有一定的治疗作用且能增加黑色素的生成。