山核桃叶总黄酮干预去势SD大鼠脂肪组织异位沉积作用研究

浙江中医药大学 杭州 310053

人体脂肪组织主要分布于皮下、内脏及血管周围，正常情况下起着调节人体生理代谢、提供干细胞等作用[1]，当脂肪组织异位沉积时会引起多种代谢异常疾病以及各类并发症。脂肪组织在腹腔内积累过多时，会引起脂肪肝、糖尿病和心血管疾病[2]。血管周围脂肪的过量沉积会造成脂肪组织分泌功能的紊乱，使脂肪组织分泌过量的炎症因子，引发动脉粥样硬化和高血压[3]。

雌激素与脂肪代谢有关，女性绝经后雌激素水平下降，容易造成体内脂肪堆积，引发肥胖[4]。笔者研究团队前期对人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231细胞的研究发现山核桃叶总黄酮具有雌激素样活性[5]；还发现山核桃叶所含黄酮成分白杨素、球松素查尔酮能够明显抑制鼠胚胎成纤维细胞的成脂分化[6-7]。本研究拟进一步观察山核桃叶总黄酮对去势SD大鼠血脂、脂肪组织分布、过氧化物酶体增殖体激活受体γ （peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ）水平的影响，探讨山核桃叶总黄酮对脂肪组织异位沉积的影响及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂 水合氯醛购自浙江省中医院（批号：20150803）；戊酸雌二醇片购自法国DELPHARM Lille S.A.S药厂（批号：188A）；山核桃叶总黄酮由浙江中医药大学制备[8-9]。总胆固醇（total cholestero，TC）检测试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（批号：20150902、20151231）；BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪生物科技公司（批号：10114）；逆转录试剂盒购自宝生物（大连）有限公司（批号：AK2601）；SYBR Premix Ex TaqTM购自宝生物（大连）有限公司（批号：AK4605）；β-actin pAB 内参蛋白一抗、PPARγ(Ser 112)-R Antibody均购自 SANTA 公司（批号：CT36001、K1314）。

1.2 实验动物 SPF级雌性SD大鼠60只，6周龄，体质量约200g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]，饲养于浙江中医药大学实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184]。饲养环境恒温恒湿，所有大鼠自由饮水，以标准饲料饲养到3月龄，体质量（250±30）g用于实验。

1.3 仪器 SMP500-17044-CXV型全波长酶标仪为美国Dynatech公司产品，NIS-Element正置显微镜为日本Nikon公司产品，HM315切片机为德国Thermo公司产品，S1000型PCR仪购于美国Bio-Rad公司，StepOne Real-Time PCR为美国Applied Biosystems公司产品，化学发光成像仪购于Clinx Science Instruments公司。

1.4 方法

1.4.1 去势大鼠模型的建立 60只SD大鼠中50只摘除双侧卵巢。以10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，大鼠取俯卧位，沿着脊柱斜向下背部切开，摘除双侧卵巢。其余10只为假手术组，切除卵巢附近与卵巢同等大小的脂肪组织。术后大腿部肌肉注射青霉素预防感染，青霉素80万单位以0.9%氯化钠注射液5mL溶解，注射剂量为1mL/只，共注射4次。

1.4.2 动物分组与给药 术后1个月将大鼠按照随机区组法分为6组：模型组、假手术组、雌二醇组、山核桃叶总黄酮低、中、高剂量组，每组10只。模型组和假手术组予0.9%氯化钠注射液灌胃，雌二醇组予雌二醇1mg/kg灌胃，山核桃叶总黄酮低、中、高剂量组分别予山核桃叶总黄酮50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg灌胃[10-11]。各组大鼠灌胃均为1次/d，灌胃容积0.3～0.4mL/只，连续给药2个月。给药期间每10d眼眶取血1mL监测血脂的变化，共取6次。

1.5 检测指标

1.5.1 一般指标 给药期间每10d称量各组大鼠体质量，实验结束时处死大鼠，称量各组大鼠的腹部脂肪和主动脉弓脂肪，计算腹部脂肪系数和主动脉弓脂肪系数。腹部脂肪系数=腹部脂肪质量（g）/体质量（g）×100、主动脉弓脂肪系数=主动脉弓脂肪质量（g）/体质量（g）×100。

1.5.2 血清和肝脏脂代谢指标检测 末次给药后，大鼠禁食12h，3%戊巴比妥钠以0.15mL/100g的剂量腹腔注射麻醉，腹主动脉取血处死。将取得的血液置于2mL离心管中，室温放置2h或37℃水浴30min后，3 000 转/min，4℃离心15min，取上层血清，分装后-80℃保存，酶标比色法测定血清TC、TG水平。取0.1g肝脏组织，加入0.3mL甲醇匀浆和0.6mL氯仿抽提，取下层抽提液，酶标比色法测定肝脏TG、肝脏游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）水平。

1.5.3 石蜡切片制作和HE染色 分离大鼠肝脏、腹部脂肪、主动脉弓，以10%甲醛溶液固定后石蜡包埋制备3μm切片，HE染色后镜下观察。

做到这一点又难又不难。说难，那是需要高智商和好体力的；说不难，只要准确理解不同的身份要求，并扮演好自己的角色就行了。当然，身份多了，难免会很累。但要在这个世界上出人头地，就不能怕累。张仲平是一个谋定而后动的人，已经习惯了在做任何事情时都权衡利弊，他觉得，只有这样，才称得上一个真正的商人和一个真正成功的男人。

1.5.4 荧光定量PCR检测PPARγ mRNA表达 分离大鼠腹部脂肪组织，液氮研磨，以Trizol法提取脂肪组织总RNA。引物由上海生工公司合成，内参GAPDH上游引物：5’-GCTAGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物：5’-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3’；PPARγ 上游引物：5’-CGTCCCCGCCTTATTATTCT-3’，下游引物：5’-GCTTTATCCCCACAGACTCG-3’。逆转录反应总体系包括总 RNA 8μL、5×Prime Script Master Mix 2μL，充分混匀后 37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 30min 逆转录反应，获得cDNA。

以 0.5μL cDNA 为模板，2×SYBR Premix Ex TagTM10μL，上下游引物各 0.5μL，ddH2O 8.5μL，总体系20μL进行荧光定量PCR反应。反应条件：94℃5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共 30 个循环；最后72℃延伸3min。每个样本扩增3个复孔，荧光定量PCR仪检测记录数据，以2－△△Ct法计算mRNA相对表达量。△△Ct=[实验组目的基因平均Ct值-实验组内参基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值]。

1.5.5 Western blot检测PPARγ蛋白表达 RIPA裂解液抽提脂肪组织中总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳上样量40μg/孔，电泳后转膜，加入一抗、二抗孵育，用ECL发光，图片用Image J软件进行分析。蛋白相对表达量以目的蛋白光密度与βactin光密度比值表示。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，满足方差齐性用LSD法，方差不齐用 Dunnett's T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脂代谢指标比较 各组大鼠体质量、腹部脂肪系数、主动脉弓脂肪系数都无统计学差异（P＞0.05）。假手术组组血清TC水平高于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05），雌二醇组低于模型组（P＜0.01），山核桃叶总黄酮低、高剂量组均高于模型组，其中山核桃叶总黄酮高剂量组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；中剂量组低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组与假手术组血清TG水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，雌二醇组和山核桃叶总黄酮各剂量组血清TG水平呈下降趋势，其中雌二醇组、山核桃叶总黄酮高剂量组与模型组比较具有统计学差异（P＜0.01）。模型组肝脏TG水平高于假手术组（P＜0.01），雌二醇组和山核桃叶总黄酮各剂量组肝脏TG水平均低于模型组，其中雌二醇组、山核桃叶总黄酮中剂量组和高剂量组与模型组差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。模型组肝脏FFA水平高于假手术组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；雌二醇组和山核桃叶总黄酮各剂量组肝脏FFA水平有下降趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。这表明山核桃叶总黄酮能够下调血清TG和肝脏TG水平。见表 1、2。

表1 各组大鼠体质量及脂肪系数比较（±s）Tab.1 Comparison of body mass and fat coefficient in each group（±s）

表1 各组大鼠体质量及脂肪系数比较（±s）Tab.1 Comparison of body mass and fat coefficient in each group（±s）

组别 n 体质量（g） 腹部脂肪系数 主动脉弓脂肪系数山核桃叶总黄酮低剂量组山核桃叶总黄酮中剂量组山核桃叶总黄酮高剂量组雌二醇组模型组假手术组1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 3 2 9.7 0 8±3 3.7 7 5 3 0 6.7 6 4±2 8.7 1 8 3 2 3.6 6 0±3 3.3 4 8 3 2 4.5 0 4±3 1.6 2 9 3 1 0.8 5 0±2 7.9 8 0 3 2 0.3 7 9±2 7.2 8 6 1.7 7 4±0.4 2 5 1.3 1 5±0.7 0 6 1.7 4 6±0.8 9 4 1.0 3 4±0.3 8 4 1.5 3 9±0.8 5 7 1.2 0 6±0.2 0 0 0.1 3 2±0.0 3 3 0.0 8 8±0.0 2 5 0.1 2 5±0.0 7 5 0.1 3 7±0.0 3 3 0.1 1 7±0.0 5 7 0.1 2 7±0.0 4 5

2.2 各组大鼠肝脏、腹部脂肪、主动脉弓脂肪病理形态比较 假手术组肝脏、腹部脂肪、主动脉弓处脂肪细胞数量较少，且体积较小，主动脉弓内膜较光滑。模型组肝索清晰，可见轻微炎性细胞浸润，肝细胞内可见脂肪滴积聚；腹部脂肪细胞较多，大小不一且聚集；主动脉弓处有较多脂肪细胞聚集，内膜增厚，管腔狭窄，内有泡沫细胞沉积。雌二醇组与假手术组相似。山核桃叶总黄酮低剂量组肝组织切片可见肝索清晰，伴有轻微的炎性细胞浸润，但脂肪滴的数量较模型组减少。雌二醇组、山核桃叶总黄酮高剂量组肝细胞内脂肪滴数量明显减少，炎性细胞浸润改善；腹部脂肪细胞体积出现不同程度减小；主动脉弓处脂肪明显减少，内膜光滑，管腔狭窄减轻，改善程度随山核桃叶总黄酮剂量升高而更明显。见图1～3。

表2 各组大鼠血清及肝脏脂代谢指标比较（±s）Tab.2 Comparison of index of lipid metabolism in blood and hepatic in each group（±s）

表2 各组大鼠血清及肝脏脂代谢指标比较（±s）Tab.2 Comparison of index of lipid metabolism in blood and hepatic in each group（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with sham operation group,#P＜0.05,##P＜0.01.

组别 n 血清TC（mmol·L-1） 血清TG（mmol·L-1） 肝脏TG（mmol·gprot-1） 肝脏FFA（μmol·gprot-1）山核桃叶总黄酮低剂量组山核桃叶总黄酮中剂量组山核桃叶总黄酮高剂量组雌二醇组模型组假手术组54.717±4.114 52.111±3.097 49.864±6.179 50.143±6.202 55.010±2.494 47.116±4.342 10 10 10 10 10 10 2.314±0.297 1.829±0.335**##2.343±0.382**##1.386±0.657**2.100±0.306 2.150±0.288 0.499±0.041 0.489±0.043 0.406±0.029**##0.407±0.046**##0.535±0.061 0.523±0.081 2.616±0.239 2.707±0.926*#2.696±0.291*#2.115±0.252**3.222±0.130 2.003±0.465**

图1 各组大鼠肝脏组织病理形态比较（HE染色，200×）Fig.1 Comparison of pathological features of liver tissue in each group(HE staining,200×)

图2 各组大鼠腹部脂肪组织病理形态比较（HE染色，200×）Fig.2 Comparison of histopathological features of abdominal adipose tissue in each group(HE staining,200×)

图3 各组大鼠主动脉弓病理形态比较（HE染色，200×）Fig.3 Comparison of pathological features of aortic arch in each group(HE staining,200×)

2.3 各组大鼠脂肪组织中PPARγ蛋白表达比较与假手术组比较，模型组PPARγ蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，雌二醇组PPARγ蛋白表达降低（P＜0.01），山核桃叶总黄酮中、高剂量组PPARγ蛋白表达也降低且具有统计学差异（P＜0.01）。见图4、表 3。

图4 各组大鼠脂肪组织中PPARγ蛋白Western blot检测结果Fig.4 Western blot results of PPARγ protein in adipose tissue in each group

表3 各组大鼠脂肪组织中PPARγ蛋白表达量比较（±s）Tab.3 Comparison of PPARγ protein in adipose tissue in each group（±s）

表3 各组大鼠脂肪组织中PPARγ蛋白表达量比较（±s）Tab.3 Comparison of PPARγ protein in adipose tissue in each group（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01。Note:Compared with model group,**P＜0.01;compared with sham operation group,##P＜0.01.

组别 n PPARγ蛋白表达量山核桃叶总黄酮低剂量组山核桃叶总黄酮中剂量组山核桃叶总黄酮高剂量组雌二醇组模型组假手术组10 10 10 10 10 10 5.038±0.130##2.295±0.067**2.347±0.316**3.133±0.209**##4.836±0.121 2.330±0.267**

2.4 各组大鼠脂肪组织中PPARγ mRNA表达比较模型组与假手术组比较，脂肪组织中PPARγ mRNA表达无统计学差异（P＞0.05）。与模型组比较，雌二醇组PPARγ mRNA表达量降低（P＜0.05），山核桃叶总黄酮低、中、高剂量组PPARγ mRNA表达呈下降趋势，山核桃叶总黄酮中剂量组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠脂肪组织中PPARγ mRNA表达量比较（±s）Tab.4 Expression of PPARγ mRNA in adipose tissue in each group（±s）

表4 各组大鼠脂肪组织中PPARγ mRNA表达量比较（±s）Tab.4 Expression of PPARγ mRNA in adipose tissue in each group（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，#P＜0.05。Note:Compared with model group,*P＜0.05;compared with sham operation group,#P＜0.05.

组别n PPARγ mRNA表达量山核桃叶总黄酮低剂量组山核桃叶总黄酮中剂量组山核桃叶总黄酮高剂量组雌二醇组模型组假手术组10 10 10 10 10 10 0.669±0.148 0.317±0.136*#0.556±0.254 0.272±0.101*#0.931±0.328 1.000±0.000

3 讨论

绝经期妇女容易发生向心性肥胖，导致心血管疾病高发[12]。脂肪异位沉积是指脂质在非脂肪组织中的

积聚，主要表现为TG在肝脏、肌肉等组织中的沉积，是肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝、多种心血管疾病等的发病原因之一[13]。体内几乎所有血管周围都被脂肪组织包绕，通常将其称为血管周围脂肪组织(perivascular adipose tissue，PVAT)。PVAT 与血糖、血脂都具有相关性[14]，其含量的增高将可能成为新的代谢性心血管病危险因素[4]。

Xu等[15]研究发现，补充雌激素可抑制去势大鼠腹内脂肪和主动脉周围脂肪积聚以及缺氧的影响，从而可以缓解去势大鼠代谢性心血管危险因素的恶化；同时还能改善去势大鼠肝脏组织的异位脂肪沉积。尽管补充外源性雌激素的方法治疗绝经期综合征及其相关疾病已得到公认，但是外源性雌激素会刺激乳腺和子宫内膜增生，增大恶性肿瘤的发生概率[16]。美国国立卫生院于2000年已将人工合成的雌激素列入致癌物质的黑名单。因此寻找具有雌激素效应但副作用小的药物已经成为治疗绝经期综合征的重要研究方向。研究发现，植物类雌激素在体内能与雌激素受体结合，具有雌激素样调节作用，如大豆异黄酮已广泛应用于绝经期综合征的治疗[17]。

本研究发现，模型组大鼠主动脉弓脂肪系数和腹部脂肪系数与假手术组比较均无统计学差异，但腹部脂肪组织切片显示，模型组大鼠腹部脂肪细胞体积大于假手术组，而山核桃叶总黄酮能够减少脂肪细胞数量，同时缩小脂肪细胞体积，这对改善脂肪组织功能紊乱有重要的意义[18]。模型组大鼠血清TC水平无显著变化，而肝脏组织的TG水平显著升高，经过山核桃叶总黄酮干预后，肝组织FFA和TG升高得到抑制；肝组织切片显示，山核桃叶总黄酮干预后，大鼠肝细胞内脂滴数量逐渐减少，表明山核桃叶总黄酮能够通过降低肝脏组织中FFA的水平从而减少TG的产生，具有植物类雌激素功效。

脂肪细胞分化和功能异常是导致脂肪过度堆积的原因之一，脂肪细胞分化能力将直接影响脂肪细胞数量。许多转录因子、信号通路均作用于脂肪细胞分化过程[19]，如PPARγ、CCAAT增强子结合蛋白家族（CCAAT/enhance binding proteins，C/EBPs） 等对前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化起决定性的作用[20-21]。本研究显示山核桃叶总黄酮能够明显降低PPARγ的表达，抑制脂肪细胞的分化，从而减少体内脂肪组织的聚集。

综上所述，本研究结果表明山核桃叶总黄酮可以改善去势大鼠脂肪异位沉积，其机制与降低肝脏TG和FFA，降低脂肪组织PPARγ的表达，抑制脂肪细胞分化有关。脂肪的沉积是一个复杂综合的过程，脂质的摄入、生成、氧化、再酯化和输出的任一步失衡都会影响脂肪的沉积[22]，山核桃叶总黄酮对于脂质的合成和氧化的调控是否有直接的作用，本课题组继续开展进一步的深入研究。