供应商的体外诊断试剂异常质量检测与分析

欧阳虎，李军祥 （上海理工大学 管理学院，上海 200093）

OUYANG Hu,LI Junxiang (Management School,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)

0 引言

在供应链管理[1]过程中，供应商的产品质量直接影响下游企业或用户的满意度，进而影响整个供应链的生存发展，特别是用于医疗方面的产品更是如此。体外诊断试剂IVD（In Vitro Diagnostics）是指按医疗器械管理的体外诊断试剂，包括在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的试剂、试剂盒、校准品、质控品等产品。可以单独使用，也可以与仪器、器具、设备或者系统组合使用。

自21世纪来，随着生物科技的发展，体外诊断试剂也经历了4次技术革命：生化、酶、免疫测定、分子诊断[2]，其中分子诊断是目前最有潜力的体外诊断试剂领域之一。最早是由James Watson和Francis Crick在20世纪中期提出了DNA双螺旋结构模型，引入了分子生物学的概念[3-4]。分子诊断主要是应用分子生物学的技术，检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的诊断，主要技术包括核酸分子杂交、聚合酶链反应（PCR）、生物芯片技术和高通量测序技术等高新技术，随着分子诊断的技术不断成熟，在肿瘤、遗传病、生殖等领域的筛查和诊断上逐渐普及，现阶段国内IVD市场上分子诊断产品多以PCR技术特别是实时定量荧光PCR为基础的产品。随着实时荧光PCR技术的发展，实时荧光定量PCR技术在临床上的应用越来越广泛[4]。

国家政策对IVD产业的大力支持，这使得国内IVD市场增长迅速，但在高端市场上占优势的多为外企，而大多数国内企业往往是单一产品低水平重复生产在低端市场上恶性竞争。如何提高国内IVD企业的竞争力，只有两条路：一是保证产品质量，二是科研创新[5]。因IVD产品的特殊性，IVD生产企业必须对IVD产品质量负责，而且这不仅是生产企业的责任，也是国内执法部门和医学界关注和研究的重点。

研究基于A公司质量部收到客户反映某批次产品在使用过程中阳性率异常。A公司就此问题进行调查，并采用了相应的方法和对策来解决问题。通过对质量问题进行排序，运用分层分析法对问题等级进行分析，并运用鱼骨图方法重点分析质量问题，找出造成该批次产品阳性率异常的成因，对分子诊断产品生产企业和使用单位都具有比较实际的参考意义。

1 问题回溯

A公司于2016年5月、8月、11月交付S医院某体外诊断试剂产品3个批次，每批80盒共计240盒。2017年4月收到S医院检验科反映在2017年第一季度中使用A公司产品检测后阳性率比2016年第三、第四季度阳性率统计均值高出30%，怀疑A公司交付的第三批产品有质量问题造成检测结果假阳性的情况。S医院决定暂停使用A公司试剂盒，并要求A公司就此开展问题调查。A公司质量部接到客户投诉后，由管理者代表牵头成立产品问题调查小组，立即启动产品质量问题调查工作。

A公司从产品生产、运输及客户使用过程中的所有流程也就是体外诊断试剂流通环节进行数据收集和分析。本次质量调查活动采用质量管理领域常用的质量工具对问题进行分析，使用的理论工具包括：调查表法，分层法[6]，排列图法，因果图法。

2 问题分析方法

2.1 质量问题分类方法

本文中，主要问题是试剂盒在使用过程中阳性率异常。由于试剂盒在配制、组装、运输过程和客户使用情况等因素，可能导致阳性率异常的原因复杂。包括人员的因素、设备的因素、原辅料的因素、方法的因素、操作环境的因素等，一般情况下上述因素对产品质量都有影响。审查A公司2016年5月至12月的生产记录、质量报告，收集产品在客户签收前所有流程的资料，包括产品开发设计输出资料。同时收集S医院检验科反映的阳性率异常问题表现、资料和相关的数据，用以确定质量问题的程度和类别。表1列出了2016年5月至2017年4月收集到的产品与阳性率有关的质量问题。

表1 造成阳性率异常的问题表现（2016.5～2017.4）

从表1中可以看出造成产品阳性率异常的主要表现是引物探针浓度偏差、产品保存环境影响和客户操作人员不当等。造成A公司产品阳性率异常的主要问题是引物探针浓度偏差，占到不良率的80%。引物是一小段单链DNA，分为上游引物和下游引物，是人工合成的两段寡核苷酸序列，引物质量的优劣直接影响试剂盒检测能力。探针也是一小段单链DNA，和引物的区别是标记有荧光集团，会和PCR扩增出的模板DNA结合，结合后可以检测到荧光，用于试剂盒检测样本的定量。引物和探针的浓度偏差，会影响PCR扩增效率导致检测样本时出现阳性率异常。

2.2 质量问题分析方法

鱼骨图法是一种常用的寻找根本问题的方法，其最大优势是能够避免因人的原因造成的信息疏漏。实际工作中由于影响质量问题的因素很多，在分析问题寻找原因时难免会有遗漏，运用鱼骨图法可以帮助管理人员有条理有层次的分析，避免遗漏情况出现。A公司对问题进行识别，判定问题负责人，由问题负责人召集相关人员针对问题点，组织多次头脑风暴从人、机、料、法、环5个层面提出问题进行分析，将收集到的原因进行分类排序分清主次绘制鱼骨图，根据鱼骨图进行分析讨论判定引起质量问题的根本原因，将原因标注在图1中。

图1 阳性率异常原因鱼骨图

3 原因分析

将客户反馈有问题批次的产品，该批次留样品和其它批次留样品进行平行试验，根据阳性率异常情况，分别按假阳性和假阴性两种情况进行分析。

3.1 引起假阳性的原因分析

引起假阳性的原因有很多，经过头脑风暴后找出所有可能引起假阳性的原因，再进一步做实验验证原因。

3.1.1 配套耗材原因。试剂盒配套耗材主要是各种型号的离心管，查生产记录追溯组装问题批次的离心管，将该批次留样品质检后，配套耗材未污染。

3.1.2 试剂盒组份原因

（1）试剂盒由PCR反应液、酶试剂和阴阳性对照组成。试剂盒技术要求规定产品组份的质检方法是将待检批次的组份和合格留样批次的组份搭配质检。

根据质检实验方案将本次问题试剂盒的组份与合格批次组份设计实验方案（见表2）。

实验结果：问题批次的酶试剂和阴阳性对照都没有问题，但PCR反应液与合格组份搭配质检时，结果异常。下一步验证对象确定为PCR反应液。

（2）由于PCR反应液是由引物、探针和缓冲液混合而成，将上述组分与合格组份混合后再进行整体质检，并制定实验方案（见表 3）。

表2 问题批试剂盒组份质检方案

表3 问题批PCR反应液组份质检方案

实验结果：发现单独缓冲液与合格引物、探针组合结果正常；与有问题引物和探针的组合，结果异常。下一步验证对象确定为引物和探针。

（3）引物和探针都是人工合成的一段单链寡核苷酸序列，以干粉形态保存。A公司引物探针采购于某合成公司。物料入库前质检项目是检查物料外包装是否完好有无破损，检查厂家是否提供引物和探针的合成浓度和纯化方式。生产配制过程是根据厂家提供的干粉浓度，用超纯水稀释至配液需要的浓度待用。

对引物和探针进行分析，首先从引物和探针的浓度着手[7]。A公司使用Thermo的nano-drop2000型分光光度计（设备编号A-设-0032，年检合格）检测引物和探针的浓度在260nm和280nm波长处的吸光值来计算引物探针的浓度。将厂家提供的浓度和检测的浓度对比后，发现两者普遍有偏差（见表4）。

表4 引物和探针浓度对比结果，上游引物（1-8），下游引物（9-16），探针（17-24）

根据对比结果，明显可见若按照厂家给的浓度稀释引物和探针后，会造成上下游引物比例偏差和引物和探针的比例偏差，两种偏差均可导致非特异性扩增导致假阳性出现[8]。引物探针的浓度偏差也会影响引物探针的稳定性，而在A公司试剂盒早期研发过程中就发现了稳定性对假阳性出现也有影响。按照自测浓度重新稀释后的PCR反应液再质检时，未出现假阳性结果，符合技术要求。

3.1.3 操作人员原因。在S医院的收集问题批次产品使用情况过程中，A公司质量部人员发现在问题批次使用期间，S医院检验科有安排实习生参与操作。经查证在实验过程中因配制用耗材用尽，实习生使用了检测室的耗材进行实验，在整理实验记录时才发现。在检测室中有大量气溶胶存在极易造成交叉污染，导致检测结果假阳性。

3.2 引起假阴性的原因分析，假阴性是指在检测阳性对照品时出现阴性结果

3.2.1 设备的原因。在调查过程中发现，S医院使用的PCR扩增仪在2017年1月28日年检到期，恰逢过年放假直到3月份才完成年检。年检时发现PCR仪96孔有3个孔的温度控制异常未按程序要求升降温，导致在此期间使用这3个孔进行扩增实验均失败，检测结果假阴性。PCR控温是对扩增反应中的变性温度和退火温度的保障，反应温度的差异直接影响扩增效果[9]。

3.2.2 环境的原因。A公司的产品保存均需在2～8°低温保存，实际使用过程中在检验室操作环境在26度，且因操作人员疏忽存在试剂盒放过夜现象。超过保存温度一定时间后会影响酶试剂的活性，酶试剂失活会导致PCR扩增失败，检测结果假阴性。

3.3 主要原因及应对措施

根据引起问题批次产品检测结果阳性率异常的主要原因是外购引物和探针的浓度偏差。物料供应商为A公司合格供方，通过对其供应的21批次引物探针留样品进行浓度检测后，除问题批次外其他20批次引物探针浓度正常。A公司质量部发函询问供应商，并对该供应商重启供应商评审活动，供应商反馈因更换合成设备导致该批次合成的探针引物浓度偏差。

本次质量部就阳性率异常现象进行了质量问题汇总，并制定了相应的纠正措施（见表5）。对纠正措施进行持续关注，定期进行质量回顾。在纠正措施落实6个月后，A公司质量部经过两次质量回顾，对新交付给S医院的产品使用情况进行跟踪调查，内部质检情况正常且未收到S医院反馈质量问题，阳性率异常现象率为0。

表5 阳性率异常质量事故问题纠正措施

4 结论

文中用鱼骨图法研究A公司生产的体外诊断试剂产品的阳性率质量问题，找出了引起质量问题的根本原因，进而建立有效的来料质检方案、质量控制手段和售后培训规范，消除了外购特殊物料和最终用户带来的质量风险。对A公司某型产品的来料检验流程的可靠性和运用荧光定量PCR法的同类体外诊断试剂产品的质量控制提供了较好的经验，获得了S医院的认可，保证了A公司的后续订单业务。