二穗短柄草Trihelix转录因子家族的基因组学分析

胡风越，刘廷武，周曼丽，周颖君，周 芮，杨立明，纪剑辉

(淮阴师范学院生命科学学院，江苏淮安223300)

在植物的转录因子家族中，研究得较为全面的是与逆境相关的转录因子，如 ABF、MYB、NAC、DREB、DOF、WRKY 等转录因子家族，对这些转录因子相关基因的恰当的转化运用，可以提高植物对逆境胁迫的耐受性［1－6］。Trihelix转录因子是与抗逆相关的转录因子家族之一，目前在拟南芥、水稻、棉花、高粱等植物中均有相关研究。研究显示，拟南芥中有30个Trihelix转录因子，而水稻中含有31个［7］。此外，由于Trihelix转录因子在光应答反应、植物生长发育和逆境胁迫中显著的调控作用［8－12］，它们对生产实践中的品种改良应用具有重要意义。二穗短柄草由于具有植株矮小、生育期短、遗传转化率高以及其与小麦基因组相似度高达95%、能同样感染小麦易感的各种细菌的特点，成为继拟南芥和水稻之后新型模式植物的理想植株，并能有效弥补模式植物水稻的不足［13－14］。本研究利用生物信息学分析手段，对二穗短柄草Trihelix转录因子家族基因进行结构特征、进化情况及染色体定位等分析，并对该基因家族在水稻、二穗短柄草以及玉米等物种染色体区段的复制作了分析，以期更全面地了解禾本科植物Trihelix基因家族。1 材料与方法

1.1 数据的收集与分析

在植物转录因子数据库(Plant Transcription Factor Database，简称TFDB)中获取水稻、二穗短柄草、玉米、高粱及拟南芥中的Trihelix基因序列，随后对相关数据进行整合分析，利用Pfam方法在水稻中检测是否存在此家族蛋白的特征结构域，借助同样的方法，完成对Trihelix特殊结构域的序列筛选，进而得到不同物种Trihelix蛋白的全部序列［15］。利用ExPASy数据库(http://www.expasy.org/)对二穗短柄草Trihelix蛋白的分子量、染色体位置、等电点等基因组信息进行在线分析［16］。

1.2 保守基序(motif)的鉴定与分析

根据 Trihelix家族保守结构域特点，在 MEME程序(http://meme.nbcr.net/meme/cgi－ bin/meme.cgi)中，将参数设置成“any”，设定这些基序的长度为10～200，预期有20个基序［17］，来分析其蛋白质保守基序。

1.3 Trihelix转录因子家族系统进化树的构建

首先对Trihelix家族特殊保守结构域的氨基酸进行多序列联配分析，应用Cluster 3.0软件分析所得结果，随后借助Mega软件(http://www.megasoftware.net/)对二穗短柄草Trihelix保守结构域作进一步分析，Bootstrap的值设定成1 000［18］，随后将 Mega 程序分析的结果借助 WebLogo 3.3 软件进行图示化，即可验证转录因子保守域的分析结果。依据二穗短柄草Trihelix特殊结构域分析的方法和步骤，采用邻接法构建出水稻、拟南芥、玉米、二穗短柄草和高粱中该家族的系统进化树［19］，发现在不同物种中，Trihelix家族均主要分为5个亚类。这一结果显示，在植物不同物种中，Trihelix转录因子家族基因仍具有较高的保守性。

1.4 Trihelix基因家族的染色体区段复制分析

利用植物基因组复制数据库(PGDD，网址为 http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)对所选的 Trihelix 基因各自所在染色体区段的线性复制情况［20］进行分析，将所有存在染色体复制关系的数据进行整理，借助基因染色体定位软件MapInspect完成图示化;此外，按照上述方法将二穗短柄草与水稻、二穗短柄草与高粱、二穗短柄草与玉米的Trihelix基因利用植物基因组复制数据库进行线性复制关系分析，相关结果借助Circos软件进行图示化［21］，便可直观地看出所需检测的染色体之间的同源性关系。

2 结果与分析

2.1 二穗短柄草Trihelix转录因子家族的鉴定

在二穗短柄草基因组数据库中共鉴定出28个Trihelix转录因子。对其蛋白质大小、分子量、等电点以及染色体位置等基本信息进行分析，结果显示其中氨基酸序列最长的有975个，最短的有128个，分子量为 14.01～96.63 ku，等电点为3.976 3～11.578 9。蛋白结构域保守型分析结果显示，氨基酸残基色氨酸(Trp，简称 W)－2、W －63、半胱氨酸(Cys，简称C)－99(2、63、99分别表示在此氨基酸序列上的第2、63、99位)具有极高保守性(图1)，且短柄草所有Trihelix转录蛋白中均包含典型的螺旋－环－螺旋保守结构。

2.2 二穗短柄草Trihelix转录因子家族的进化分析

依据Trihelix蛋白保守序列特点，在MEME程序中采用邻接法构建了二穗短柄草Trihelix基因家族的进化树(图2)，结果将二穗短柄草Trihelix基因家族分为5个亚类。在数量分布上，亚家族Ⅳ中含有最少的Trihelix转录因子，而亚家族Ⅴ含有的Trihelix转录因子最多;在分支结构上，亚家族Ⅰ和Ⅱ的同源关系相对较近，且可看出在亚家族Ⅴ上的Bradi3g45230基因与其他Trihelix基因的亲缘关系较远。此外，对水稻、拟南芥、二穗短柄草和高粱中的Trihelix蛋白进行聚类分析发现，Trihelix家族均分为5个亚类(Ⅰ～Ⅴ)(图3)，且每个亚类中均有Trihelix转录因子分布，由此可清晰地看出各物种中Trihelix转录因子之间的同源关系。高粱、玉米的Trihelix基因进化距离较长，分别有近71%、69%的基因在进化树的末端才分支，因而推测这2个物种Trihelix基因的进化较晚，其次是二穗短柄草和拟南芥，最早的是水稻。

2.3 二穗短柄草Trihelix家族全长蛋白的结构性分析

基于MEME程序的蛋白结构域分析结果显示，二穗短柄草的28个Trihelix转录因子同样可被分为5个亚家族，与上述进化树分析结果一致。就同一亚家族内结构特点分析可知:亚家族Ⅰ中都含有保守基序Motif2、Motif1和Motif5，亲缘关系更为接近的Bradi3g46210和Bradi5g11070基因表达蛋白的C端都含有Motif16;亚家族Ⅱ中共有的保守基序与亚家族Ⅰ相比不含有Motif5;亚家族Ⅲ中均存在Motif1和Motif8;亚家族Ⅳ的显著特征是含有1段由Motif3、Motif1和Motif12相邻构成的保守序列;亚家族Ⅴ中亲缘关系较近的Bradi3g00697、Bradi5g17150、Bradi1g77610 和 Bradi3g30457均含有Motif 3，均与Motif19紧密相邻，且后3种Trihelix转录因子的同源性更高。在不同亚家族之间，根据Motif5和Motif2判断亚家族Ⅰ和亚家族Ⅱ在系统发生上亲缘关系更接近。此外，在所有Trihelix转录因子中Motif1蛋白序列高度保守(图4)。

2.4 二穗短柄草Trihelix转录因子家族在染色体上的定位

用Mapinspect软件分析图示，可见二穗短柄草的28个保守Trihelix基因在5条染色体上均有分布(图5)，在3号染色体上分布最多，有9个Trihelix基因，而在1号和4号染色体上最少，仅有3个。并且，Trihelix基因在同一染色体上还存在聚集现象。如在3号染色体上9个Trihelix基因聚集在3个区段，分别位于0.27、32、46 Mb附近;而5号染色体上所有Trihelix基因均聚集在11～28 Mb区段，即位于染色体长臂区段。

2.5 二穗短柄草Trihelix转录因子在二穗短柄草、高粱、玉米和水稻中的染色体复制分析

由于高粱、水稻和玉米均为单子叶植物，其相互之间亲缘较近，所以通过比较二穗短柄草与这三者之间的染色体复制情况，可以分析Trihelix基因在种内和种间的进化轨迹。复制分析结果见图6，可见二穗短柄草的染色体有5对，首先，其自身同一亚家族的Trihelix基因会形成复制关系，其次，二穗短柄草与高粱(10对染色体)、水稻(12对染色体)和玉米(10对染色体)也形成了线性复制。据此可推测，在物种进化过程中可能发生了染色体加倍、易位，以及基因的复制、重排、缺失和一些同源基因的丢失等进化事件。

3 讨论与结论

Trihelix转录因子又称为GT因子家族［22－23］，因其含有3个螺旋环的特殊保守结构而得名，并且其结构与MYB转录因子家族极为相似，但因连接helix的结构不同(“环”或“转角”)而造成功能上的差异，在系统发生上，Trihelix转录因子可能来源于1 个 MYB －like基因［24－25］。

Trihelix转录因子最初只在植物中发现，后来有研究推测可能在人类和果蝇中也存在，陆婷婷研究表明，Trihelix转录因子在动物和植物中有不同的结构，绝大多数植物Trihelix蛋白为单Trihelix功能域蛋白，而动物中单Trihelix功能域占少数，取而代之出现了3个Trihelix功能域蛋白和6个Trihelix功能域蛋白，且多伴有其他功能域如SCAN功能域［由C2H2锌指蛋白家族成员SRE－ZBP、Ctfin51、AW－1(ZNF174)和Number 18组成］，以辅助调节动物的生长代谢过程［26］。而在功能上，植物中Trihelix转录因子主导光应答、植物生长发育中的蛋白表达调控以及与抗干旱、耐盐、冷害、病害等逆境胁迫应答相关［11，27－28］，动物中 Trihelix蛋白辅助调控生长代谢，具体功能仍待探索。

本研究通过对二穗短柄草Trihelix转录因子的生物信息学分析，共鉴定出5个亚家族共28个Trihelix转录因子基因，水稻中是5个亚类31个Trihelix转录因子基因，二穗短柄草中Trihelix转录因子数量虽不及水稻，但从聚类分析结果来比较，仍具有较高的相似性。水稻、高粱和玉米Trihelix多基因进化关系构建结果同时表明，Trihelix在物种间的进化晚于在物种内的进化;此外，依据Trihelix转录因子在系统进化树上的进化距离，推测Trihelix在高粱和玉米中的进化最晚，在二穗短柄草和拟南芥中次之，最早是在水稻中，但此结论需要进一步研究证实。

综上，通过对单子叶禾本科模式植物二穗短柄草的生物信息学研究，分析其Trihelix转录因子家族基因的鉴定、结构特征、进化特点、染色体定位及复制情况，从而对禾本科植物的Trihelix转录因子有更全面的了解，为小麦等其他未测序物种的基因功能分析奠定了基础。