联合应用P16、Ki-67免疫组织化学染色半定量评分对CIN病变的分级预测

沈晓健，朱东兵，环 静，孙 健

(1.江苏省如皋市人民医院病理科 226500；2.山东省青岛市立医院血液净化中心 266071)

宫颈癌在我国发病率、病死率较高，是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，严重危害女性健康[1]。流行病学研究结果显示，宫颈癌的发生主要与人乳头瘤病毒(HPV)感染，特别是高危型HPV持续性感染有关，随着世界范围内的HPV感染发生情况日益增多，宫颈癌的发病率也逐年升高[2]。近些年，随着细胞学筛查技术和HPV分子生物学技术的不断发展，对于宫颈癌癌前病变的发现及治疗也在不断更新[3]。越来越多国外研究发现，P16联合Ki-67染色能有效减少临床工作人员对组织形态学的过度依赖，以客观的蛋白表达提示组织细胞所处的增殖状态，且P16、Ki-67的表达可能与宫颈病变诊断以及宫颈HPV感染存在一定的相关关系。因此联合应用P16、Ki-67免疫组织化学染色及其半定量评分有可能成为宫颈癌癌前病变筛查、诊断、治疗及预后的新靶点[4-6]。本研究以此为依据，采用细胞学-HPV检测-阴道镜检查三阶梯筛查方案对200例液基薄层细胞学检测(TCT)诊断异常[非典型鳞状上皮细胞-意义不明(ASC-US)及以上]的患者进行检测，探讨联合应用P16、Ki-67免疫组织化学染色半定量评分在不同宫颈上皮内瘤变(CIN)分级诊断中的表达情况，以及P16的表达与宫颈HPV感染的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年6月至2014年6月经如皋市人民医院妇科门诊TCT筛查[7]诊断异常(ASC-US及以上)的200例患者作为本次研究的对象，排除全身性疾病，以及糖尿病、冠心病及其他恶性肿瘤等患者。按照常规HE染色病理诊断对患者进行分组：其中112例诊断为宫颈慢性炎症，42例为CINⅠ级，20例为CINⅡ级，18例为CINⅢ级，另有8例确诊为宫颈癌。所有患者均已被告知本研究相关内容，自愿参加本研究并已签署相关的知情同意书。

1.2方法 (1)采用TCT技术收集患者宫颈脱落细胞，分离、提取分泌物中的细胞DNA，采用HPV分型检测试剂盒[聚合酶链反应(PCR)+膜杂交法，凯普公司]对细胞DNA进行PCR扩增及核酸分子快速导流杂交，同时检测患者脱落细胞中的HPV亚型。(2)将患者病理组织制成石蜡切片，脱蜡、进水，浸入乙二胺四乙酸二钠的修复液，于高档微波12 min使抗原热修复。为阻断内源性过氧化物酶活性，于室温滴加100 μL过氧化氢，孵育10 min。滴加100 μL一抗(抗稀释度P16为1∶100，Ki-67为1∶50)，于室温孵育90 min。滴加100 μL PV-6000二抗，孵育20 min。滴加新鲜配制的100 μL二氨基联苯胺溶液，于显微镜下观察显色[2]。采用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，阳性对照采用明确表达P16和Ki-67的宫颈癌组织。

1.3评价指标 (1)细胞学诊断标准[8]：阴性表现为TBS诊断系统报告正常范围内或炎症，阳性表现为未明确意义的ASC-US、不典型腺细胞(ASC-H)及以上级别病变。(2)HPV分型检测判读标准：高危型病毒包括HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-56、HPV-58、HPV-59及HPV-68等13种亚型；其中单一型感染可划分为高危型(HR-HPV)和低危型(LR-HPV)；混合感染的HR-HPV中至少含有一种HR-HPV，LR-HPV感染则全部为LR-HPV。(3)CIN分级诊断标准：病理组织切片由两位病理科医师单独进行阅片并对CIN作出免疫组织化学分级诊断。阳性信号表示P16在细胞核和细胞质中都有表达，而Ki-67仅在细胞核表达。根据P16和Ki-67的表达强度和分布对阳性结果进行半定量评分：“-”表示P16不表达，仅细胞质染色或局灶表达阳性，Ki-67不表达或仅基底或基底旁表达；“+”表示染色位于基底及基底旁细胞；“++”表示染色位于基底下1/3内的细胞；“+++”表示染色位于超过基底下1/3而不足2/3的细胞；“++++”表示染色位于超过基底下2/3的全层细胞。

1.4统计学处理 将本组研究数据录入SPSS19.0行数据分析，计数资料以例数或率表示，组间比较行χ2检验，等级资料的相关性分析采用Spearman秩相关，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1P16的表达结果 宫颈慢性炎症组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组以及宫颈癌组中，P16的阳性表达率分别为0(0/112)、71.43%(30/42)、100.00%(20/20)、100.00%(18/18)、100.00%(8/8)，且随着宫颈CIN病变程度越高，P16表达的阳性程度越高，差异有统计学意义(χ2=156.012，P<0.01)。由相关性分析可得P16阳性表达的Spearman秩相关系数为0.846(P<0.01)，且P16表达的阳性程度对CIN病变分级诊断的敏感度为86.36%，特异度为100.00%，准确度为94.00%。见表1。

表1 宫颈病变中P16表达比较(n)

表2 宫颈病变中Ki-67表达比较(n)

表3 P16、Ki-67免疫组织化学染色半定量评分分级诊断结果

2.2Ki-67的表达结果 宫颈慢性炎症组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组以及宫颈癌组患者Ki-67的阳性表达率分别为0(0/112)、49.05%(29/42)、100.00%(20/20)、100.00%(18/18)、100.00%(8/8)，且随着宫颈CIN病变程度越高，Ki-67表达的阳性程度越高，差异有统计学意义(χ2=152.727，P<0.01)。由相关性分析可得Ki-67阳性表达的Spearman秩相关系数为0.732(P<0.01)，且P16表达的阳性程度对CIN病变分级诊断的敏感度为85.23%，特异度为100.00%，准确度为93.50%。见表2。

2.3联合应用P16、Ki-67免疫组织化学染色半定量评分分级诊断及其与HE分级诊断的一致性 各组患者P16和Ki-67免疫组织化学染色半定量评分分级诊断结果见表3。宫颈慢性炎症患者的诊断一致率为100.00%(112/112)，CIN患者的诊断一致率为85.22%(75/88)。见表4。

2.4P16与HPV感染的关系 P16呈阴性表达“-”HPV感染率为57.26%(71/124)，“+”为78.57%(11/14)，“++”为85.12%(23/27)，“+++”为88.00%(22/25)，“++++”为90.00%(9/10)，说明P16表达的阳性程度越高，HPV感染的发生率越大，差异有统计学意义(P<0.01)。P16不同表达情况的患者中HPV-16、HPV-58、HPV-52、HPV-18、HPV-68和高危混合型感染率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表4 P16和Ki-67半定量评分分级诊断与HE分级诊断的一致性[n(%)]

表5 P16表达的阳性程度与HPV分型的关系(n)

注：-表示无数据

3 讨 论

宫颈癌是目前临床上唯一一种已明确病因的恶性肿瘤[9]。近年来UIJTERWAAL等[10]提出了通过对宫颈脱落细胞进行筛查和阴道镜活检等方法能有效提高对宫颈癌诊断的准确性。CIN作为与宫颈癌密切相关的一组癌前病变，通过对CIN尽早诊断和相应有效治疗，可明显减少宫颈癌的发病率和病死率。有研究报道，宫颈癌患者宫颈脱落细胞中的P16和Ki-67等因子在癌症不同发展阶段中的表达程度存在一定的差异性。因此，检测患者宫颈脱落细胞P16和Ki-67的表达程度，对宫颈癌的诊断以及CIN分级具有非常重要的临床价值[11]。

P16是一种定位于染色体9p21的抑制蛋白，其生物效应极为广泛，具有强有力的细胞增殖的活性，能阻止抑癌基因视网膜母细胞瘤基因(pRB)磷酸化，从而抑制DNA合成。因此，P16在机体抑癌机制的过程中具有十分重要的地位，其在宫颈脱落细胞中的表达程度被多数学者认为是反映宫颈癌CIN分级最敏感的指标。已有大量资料表明，早期宫颈脱落细胞中P16的异常表达与多种原发性肿瘤密切相关，近年来又有报道称P16在宫颈癌及高级别CIN中出现过表达的现象。因此，通过检测宫颈上皮脱落细胞中P16的表达还有助于提示HPV感染以及帮助临床鉴别CIN的分级[12]。Ki-67是一种存在于除G0期以外的所有细胞周期中的对肿瘤具有较高敏感度和特异度的细胞表达因子，是检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标。有研究报道，Ki-67在正常宫颈慢性炎症组织、低级别CIN宫颈组织、高级别CIN宫颈组织及宫颈癌组织中的表达程度具有明显的差异，在一定程度上可反映肿瘤的生物学发展和肿瘤细胞的增殖活性，有效指导临床对肿瘤的治疗和预后[13]。

本研究通过联合应用P16、Ki-67免疫组织化学染色半定量评分对宫颈病变进行病理诊断分级并对比常规HE染色病理诊断，结果显示:伴随CIN病变程度越高，P16和Ki-67的阳性表达程度呈逐渐上升的趋势，即P16和Ki-67的阳性表达强度越高提示CIN等级越重，差异有统计学意义(P<0.01)，且联合应用P16、Ki-67免疫组织化学染色半定量评分对比常规HE染色对宫颈慢性炎症患者的诊断一致率为100.00%，对宫颈CIN患者的分级诊断一致率为85.22%。联合应用P16、Ki-67免疫组织化学染色半定量评分对CIN级别的预测具有非常重要的意义，可应用于CIN病变分级的筛查或辅助诊断。

目前已确定的HPV基因型总共有120余种，其中有40余种HPV亚型与人体生殖系统病变有关。临床案例研究结果显示，高危混合型HPV亚型具有极高的恶变倾向，是导致宫颈癌的主要原因之一[14]。本研究中200例TCT诊断异常的患者宫颈脱落细胞标本中，HPV阳性检出例数为136例，阳性检出率为68.00%，且HPV感染率随着P16表达强度升高而增高。其中P16不同表达情况的患者中HPV-16、HPV-58、HPV-52、HPV-18、HPV-68和高危混合型感染率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明宫颈病变患者HPV的感染亚型与P16的表达程度有一定的关系，且HPV主要基因型别为16、58、52、18、68和高危混合型。

综上所述，CIN级别越高，P16、Ki-67表达越强烈。因此，联合应用P16、Ki-67免疫组织化学染色半定量评分能客观反映宫颈CIN患者的病变分级，可显著提高对宫颈癌癌前诊断的敏感度，提示细胞表达因子的检查在CIN诊断和筛查方面起到重要作用。P16水平与宫颈CIN病变合并HPV感染患者的预后及转归具有一定的相关性。