RTFQ-PCR检测儿童肺炎支原体16S rRNA的临床意义

刘君丽

(湖北省武汉市蔡甸区人民医院检验科 430050)

临床急性呼吸道感染中较为常见的病原体是肺炎支原体(MP)，特别在儿童肺炎病原体中尤为常见。儿童社区获得性肺炎中有30%患儿是由MP所引起，但其他一些病原体感染所引起肺炎和MP感染所引起肺炎在临床体征和症状方面没有特殊差异，所以很难及时地进行诊断和治疗，造成抗菌药物在临床治疗中滥用[1-2]。诊断MP金标准是直接对病原体进行检测，但由于MP生长非常慢，培养需要很长时间，而且对病原体分离条件要求高，使其在临床应用上受到很多的限制[3]。咽拭子标本内MP-DNA能够在实时荧光定量聚合酶链反应(RTFQ-PCR)中较快检测出来，是目前临床上使用较为广泛的MP所导致肺炎的检测手段。本文通过RTFQ-PCR对儿童MP 16S rRNA的检测，以期为患儿治疗提供一些新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2014年12月至2016年12月在本院接受治疗的肺炎患儿156例。入选患儿的诊断依据：(1)在发病的4周内双份血清MP抗体滴度上升4倍以上；(2)符合《实用儿科学(第7版)》中肺炎的诊断依据。根据是否MP感染将以上患儿分为MP感染肺炎(MPP)组、非MP感染肺炎(非MPP)组，另选24例健康儿童纳入对照组。3组研究对象的一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经医院伦理委员会批准。

表1 3组研究对象临床资料状况对比

注：-表示无数据

1.2仪器与试剂 仪器：高速的低温离心机(德国Eppendorf公司生产)、离心沉淀机(德国Heraeus公司生产)、RTFQ-PCR扩增仪(美国BIO-RADicycler公司生产)、微量的移液器(德国Brand公司产生)。试剂：Mp 16S rRNA试剂盒(中国达安基因有限公司生产)、SERODIA-MYCOⅡ的试剂盒(日本富士瑞必欧公司生产)。

1.3MP抗体的血清学检测 使用明胶颗粒载体的凝集试验对MPP组和非MPP组患儿的MP特异性抗体进行检测，依据试剂盒的说明书来进行[4]。

1.3.1反应图像的判定[5](1)颗粒呈现出纽扣形状的集合，外部的周边比较均匀且呈现为平滑圆形判定为(-)；(2)颗粒呈现为小环形状，外部的周边比较均匀且呈现为平滑圆形判定为(±)；(3)颗粒的环形显著变大，外部的周边不够杂乱，不均匀分布在四周判定为(+)；(4)底部的颗粒集合表现为膜形状的延伸判定为(++)。

1.3.2阳性判别依据[6]单份的血清MP抗体>1∶150时判定为MP抗体阳性。

1.3.3血清标本的动态收集 (1)患儿第1份血清MP抗体>1∶150，在第1次采血后的两周再次进行采血，作为第2份的血清标本；(2)第1份血清MP抗体<1∶150，在第1次采血的4周后或者MP血清抗体呈现4倍以上升高再收集第2份血清标本。

1.4RTFQ-PCR检测 RTFQ-PCR对MP 16S rRNA的基因进行检测，检测标本为患儿支气管的肺泡灌洗液，拷贝量大于103copy/mL时判定为阳性[7]。PCR扩增与结果判定的依据：计算荧光强度曲线判别标本到达临界的阀值时所使用循环数量(Ct值)，Ct值<29.0判定为阳性，Ct值≥29.0判定为阴性[8]。

2 结 果

2.1患儿首份血清的MP抗体检测情况 156例患儿中两份血清的MP抗体有4倍以上升高者112例，两份和单份血清MP抗体检测结果差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。在确诊的MPP患儿中，检测出阳性者64例，检测的敏感度为56.27%；在对照组24例幼儿与非MPP组44例患儿内检测出阴性者28例，假阳性者40例，特异度为40.98%；单份血清检测的阴性预测值为37.11%，阳性预测值为62.02%，MP诊断的正确率为50.89%。

表2 检测患儿两份血清MP抗体情况对比(n)

注：χ2=3.105，P<0.05

2.2RTFQ-PCR对MP 16S rRNA检测情况 本研究检测的重复率较好，批间变异系数(CV)为3.03%，批内CV为0.94%，标准曲线斜率是-2.904，线性的相关系数r为0.973。线性方程为Y=-2.793+39.004。阳性标本拷贝的数值(10.01×103)～(3.98×103)copy/mL，平均为(6.04±0.57)×103copy/mL。见图1～2。

图1 RTFQ-PCR检测批内重复性

图2 部分样品和质控品扩增的曲线

2.3RTFQ-PCR对MP 16S rRNA检测正确性 112例确诊MP感染患儿中RTFQ-PCR检测出阳性109例，敏感度为97.30%；对照组24例和非MPP组44例患儿中检测出阴性68例，特异度为100.00%；RTFQ-PCR检测的阴性预测值为97.10%，阳性预测值为100.00%。见表3。

表3 RTFQ-PCR对MP 16S rRNA的检测结果比较(n)

注：χ2=24.174，P<0.05

2.4RTFQ-PCR对MP 16S rRNA检测的拷贝量与患儿病情程度联系情况 难治性MPP检测出基因拷贝数量为(6.32±1.80)copy/mL，比普通型MPP水平[(1.51±0.02)copy/mL]要高，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

伴随着MP领域中分子生物学的广泛使用，PCR技术对MP感染的快速检查已成为近些年来发展较快的一种检查MP的方法[9]。相关研究显示，PCR对MP感染检测敏感度为76.0%，比抗原检测方法(8.4%)与培养法(26.0%)要高很多，但是PCR检测假阴性率仍然比较高，而且普通PCR在操作中容易受到外界的污染，不利于在临床广泛使用[10-12]。

目前，新核酸检测技术RTFQ-PCR发展起来，它检测结果快，操作流程也比较简单，整个过程是在封闭空间内进行的，也没有普通PCR后续的操作步骤，操作中污染的发生概率很小，也降低了假阳性率。相关研究显示，RTFQ-PCR能够精准、敏感、快速地检测MP-DNA中的基因，整个检测过程只需要数小时，而且敏感度和特异度都比较高，可得知患儿体内MP的复制与感染状况，在诊断MP感染中有广阔应用前景[13-15]。本研究显示，MP感染血清学检测中，单份血清检测的阴性预测值只有37.11%，阳性的预测值为62.02%，MP诊断的正确率仅为50.89%。而使用RTFQ-PCR对患儿支气管的肺泡灌洗液检测结果其特异度为100.00%，阴性预测值为97.10%，阳性预测值为100.00%，各项指标均优于血清学的检测结果。本研究也发现，病情严重患者其基因拷贝数量也更高，说明病情严重的患儿其体内MP的复制更加活跃。在临床上若怀疑患儿为严重的MP感染，则需要及时采用大环内酯类药物进行治疗，从而抑制MP的增殖。患者体内的MP复制较多时，体内黏液纤毛组成的清除系统受到的侵害就越严重，所以在临床治疗上采用大环内酯类药物的同时还要清除对黏液纤毛系统的侵害。由于大部分MP感染对大环内酯类药物高度敏感，临床诊断越早，用药越早，可明显降低MP感染程度；同时MP感染易诱发全身免疫反应及引起胸腔积液，前期使用糖皮质激素对减轻症状、改善预后有重要影响；另外，对大环内酯类药物耐药和免疫功能较差患儿可给予免疫球蛋白，改善机体免疫状态，减少合并感染发生。

综上所述，RTFQ-PCR检测儿童MP 16S rRNA基因是诊断前期MP感染肺炎的可靠方法，效果好于血清MP抗体的检测，值得临床关注。