水与食品中诺如病毒检测技术研究

梁锦填 黎小鹏 姚德祥 陈杰良 陈楠 高文彬 周嘉诚 马世柱

摘要 采用Trizol法、硅胶柱法、磁珠法分别提取病毒核酸，通过实时荧光PCR检测比较效果，选择最优提取方法；采用MCE-PEG富集法（混合硝酸纤维素膜第1次富集和聚乙二醇沉淀第2次富集）对水中诺如病毒进行富集；对生蚝肠腺、鳃组织进行前处理后，用磁珠法提取病毒核酸，通过实时荧光PCR检测。结果表明，硅胶柱法提取核酸效果较好；MCE-PEG法富集水中诺如病毒有效；实时荧光PCR技术能检测出染毒贝类中的诺如病毒。

关键词 诺如病毒；核酸提取；MCE-PEG富集法；实时荧光PCR

中图分类号 TS207.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）17-0239-03

Abstract The virus nucleic acid was extracted by the Trizol method，the silica gel column method and the magnetic bead method.The comparison effect was detected by real-time fluorescent PCR，and the optimal extraction method was selected.The MCE-PEG enrichment method（first enrichment of mixed nitrocellulose membrane and second enrichment of polyethylene glycol precipitation）was adopted.After pretreatment of the gut and gill tissue，the viral nucleic acid was extracted by magnetic bead method and detected by real-time fluorescent PCR.The results showed that the silica gel column method was better for extracting nucleic acids；the MCE-PEG method was effective for enriching Norovirus in water；real-time fluorescent PCR technology could detect Norovirus in infected shellfish.

Key words Norovirus；nucleic acid extraction；MCE-PEG enrichment method；real-time fluorescent PCR

長期以来，食源性疾病频发，严重影响人类健康。研究发现，病毒在食源性疾病的传播中也占有重要地位[1]。诺如病毒（Norovirus，NVs）属于脊椎动物病毒（Vertebrate Virus）杯状病毒（Caliciviridae），是非细菌性急性病毒性肠胃炎暴发的主要原因，是引起儿童和成人散发性急性肠胃炎的主要因素，常在餐馆、医院、学校、家庭及其他人群中暴发。诺如病毒为球形，呈20面体对称。从胃肠炎患者粪便中提取的NVs的cDNA全序列分析表明，NVs基因组为7.5～8.0单股正链RNA病毒[2]。其基因组包括3个开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs），分别编码非结构蛋白、衣壳蛋白和一种功能还不清楚的蛋白[3]。

NVs传染发生几率高（>50%），且少量（10～100个）的病毒粒子即可引发感染[4]。NVs在离体条件下的存活力很强，主要通过被污染的食物进行传播，该类病毒通过粪—口途径进行传播；此外，接触食物、表面、手、水都是传播的重要途径。美国CDC数据显示，12%的NVs是人与人之间的传播，39%的NVs暴发是由蔬菜、色拉、双壳贝类、禽类等食源性载体传播的。世界上最常见的基因型是GGⅡ/4型NVs，我国病人感染的NVs也是以基因组GGⅡ/4型为主[5]。

本文通过比较Trizol法、硅胶柱法及磁珠法提取核酸的效率，选择最简单易行且提取效果好的方法进行核酸提取；采用MCE-PEG富集法对水中诺如病毒进行富集；取生蚝肠腺、鳃组织进行人工染毒，前处理的贝类经实时荧光PCR检测。PCR方法检测技术具有直观、敏感性高、重复性好、可定量、速度快、操作简便、污染少、实时定量等诸多优点，可以为食品以及水中的诺如病毒检测提供科学参考，进而确保人类饮食安全。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂及试剂盒。试剂：氯仿、纯净水（经高压消毒）、2.5 mol/L MgCl2、1 mol/L盐酸、饱和NaOH溶液、含3%牛肉膏及0.05 mol/L甘氨酸的混合液（pH值9.5）、40%PEG-6000、5 mol/L NaCl溶液、甘氨酸（0.05 mol/L）-NaCl（0.15 mol/L，pH值9.5）、氯仿-丁醇（1∶1）。

试剂盒：核酸检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司，货号DR-0045-02）、QIAamp？誖MinElute？誖Virus Spin Kit（货号57704）、Maxwell？誖16 Viral Total Nucleic Acid Purif-ication Kit试剂（美国Promega公司，货号021165）。

1.1.2 试验仪器。KS130圆周振荡器（德国IKA公司）、Megafuge 11R高速冷冻离心机（美国Thermo SCIENTIFIC公司）、K20B干式恒温器（中国广州正一科技有限公司）、生物安全柜、Maxwell AS200-LX核酸提取仪（美国Promega公司）、MS3 digital 微型涡旋振荡器（德国IKA公司）、CFD-3220 Opticon 2实时荧光定量检测仪（美国Opticon公司）、0.45 μm混合硝酸纤维素膜（Sartorious公司，货号11406-47-ACN）、真空抽滤器、FE20酸度计。

1.1.3 粪便标本。粪便样本L、M为中山市某医院疑似诺如病毒感染病例，经过PCR检测及测序确认为诺如病毒后，在12 mL病毒保存液中加入500 μL粪便，振荡10 min，在3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液放置于-70 ℃ 保存备用。

1.1.4 食品样本。贝类（生蚝），购自中山市东区库充市场。

1.2 试验方法

1.2.1 核酸提取方法。第1种方法是Trizol法，步骤如下：①取液态样本各200 μL，放置于1.5 mL灭菌离心管，加入Trizol试剂400 μL、氯仿200 μL，振荡20 s后静置3 min，再在12 000 r/min条件下离心2 min；②取无色上层液体，注意不触及中间絮状层，转移至1.5 mL离心管中，然后加入RNA提取液A 10 μL，再充分混匀，在8 000 r/min条件下离心1 min后，弃去所有液体；③加入无水乙醇400 μL，充分振荡混匀，在8 000 r/min条件下离心1 min，将液体去除干净，此过程中避免触及沉淀颗粒；④将装有沉淀的离心管摆放在通风橱中风干15 min，然后加入DEPC H2O 30 μL，吸取混匀管中沉淀，得到白色悬浊液，直接用于检测。

第2种方法是硅胶柱法，步骤如下：①在200 μL粪便处理液中加入25 μL QIAGEN 蛋白酶及200 μL AL缓冲液（含有28 μg/mL的Carrier RNA），56 ℃孵育15 min后加入250 μL无水乙醇，充分混匀，短暂离心；②将步骤①所得的液体全部加入到QIAamp MinElute柱中，在8 000 r/min条件下离心1 min，加入500 μL AW1液，在8 000 r/min条件下离心1 min，弃去废液，再加入500 μL AW2液，在8 000 r/min条件下离心1 min，弃去废液，再加入500 μL无水乙醇，在8 000 r/min条件下离心1 min，弃去废液，再在14 000 r/min条件下离心2 min，最后加入50 μL DEPC 水，在8 000 r/min條件下离心1 min洗脱。

第3种方法是磁珠法，按Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification Kit试剂盒说明书提取。

1.2.2 MCE-PEG富集法。第一步是纤维素膜第1次富集病毒，即向1 L纯净水中加入含有诺如病毒的粪便悬液原液1 mL，水样中加入2.5 mol/L MgCl2 20 mL，使其终浓度达到0.05 mol/L；用1 mol/L盐酸调节水样使pH值=3.0；采用真空抽滤使之通过0.45 μm混合硝酸纤维素膜，剪碎混合硝酸纤维素膜，放入50 mL离心管中，并加入玻璃珠和20 mL含3%牛肉膏及0.05 mol/L甘氨酸的混合液（pH值9.5），在圆周振荡器上振荡30 min，洗脱滤膜[6]。

第二步是沉淀第2次富集病毒，即向含有病毒的洗脱液中加入40%PEG-6000，使终浓度为10%；加入5 mol/L NaCl溶液，使终浓度为0.3 mol/L；充分混匀，于4 ℃下静置过夜；在4 ℃、10 000 r/min条件下离心30 min后弃上清液，保留沉淀用500 μL纯净水重悬，待提取病毒RNA[7]。

1.2.3 贝类中诺如病毒的检测方法。取生蚝肠腺组织及蚝腮，剪碎搅拌成均质状，称重每份10 g分装。分为阳性肠腺组织、阴性肠腺组织对照、阳性蚝腮和阴性蚝腮对照4组，另设1个病毒液组。每组加入500 mL诺如病毒阳性粪便上清，水平摇床30 min，充分混匀。加入20 mL甘氨酸（0.05 mol/L）-NaCl（0.15 mol/L，pH值9.5），剧烈漩涡振荡5 min，在5 000 r/min条件下离心10 min，吸上清按1∶1的比例加入氯仿-丁醇（1∶1），漩涡振荡5 min，然后在5 000 r/min条件下离心10 min，吸取上清（注意在冰上操作）。上清调节pH值为7.2～7.5，加入40%PEG-6000，使终浓度为10%；加入5 mol/L NaCl，使终浓度为0.3 mol/L。充分漩涡混匀，置于4 ℃冰箱沉淀过夜。然后在10 000 r/min条件下离心30 min。弃上清，沉淀用1 mL DEPC水重悬。重悬液中按1∶1的比例加入氯仿-丁醇（1∶1）；剧烈振荡5 min，在5 000 r/min条件下离心5 min，取上清待提取RNA[8]。

1.2.4 实时荧光PCR检测。PCR反应体系（25 μL）：NV GⅡ型核酸荧光检测混合液19 μL 、RT-PCR酶1 μL、RNA 5 μL。

PCR的反应条件：45 ℃ 10 min逆转录；95 ℃预变性15 min；95 ℃变性15 s；60 ℃退火60 s，45个循环。于60 ℃ 60 s退火阶段采集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 3种核酸提取方法的比较

M样和L样为2个含诺如病毒的粪便样品，将它们分别稀释于1 L纯净水中，经富集后采用Trizol法、硅胶柱法和磁珠法3种方法提取核酸，经实时荧光PCR所得的CT值如表1所示。通过比较发现，经硅胶柱法提取核酸检测到的CT值最小，即检测出的核酸拷贝数最高，而经Trizol法和磁珠法提取核酸后所测到的CT值比硅胶柱法提取核酸所测到的结果大，证明硅胶柱法提取核酸效果较好。

2.2 MCE-PEG法富集水中诺如病毒的效果

把含有诺如病毒的粪便悬液原液M样按10倍系列度稀释为10-3、10-4、10-5共3个梯度，每管分装1 mL。各个梯度的粪便稀释液分别加入1 L纯净水中，进行MCE-PEG法的第1次及第2次病毒富集。用磁珠法提取病毒核酸，经实时荧光PCR检测所得结果如表2所示。由于L样经实时荧光 PCR检测所得的CT值较高，故把其稀释为10-1，经与M样相同的处理方法所得结果如表2所示。

设计这步试验步骤的主要目的是比较M样和L样，以确保贝类成功染毒，为进一步试验提供保证。从结果来看，M样稀释了10-5后的CT值比L样原液小，即M样原液所含病毒浓度远高于L样原液，可用M样进行进一步试验。同时，对M样进行初步定量，为日后的定量试验提供依据。此外，MCE-PEG法富集水中诺如病毒，效果显著，证明本方法可用于富集水中的诺如病毒。

2.3 贝类中诺如病毒检测结果

用磁珠法提取的病毒核酸经实时荧光PCR检测，所得数据如表3所示。可知，经染毒的生蚝肠腺组织和腮组织，实时荧光PCR检测结果为阳性，而没有吸附在生蚝组织的病毒及未被染毒的生蚝组织，检测结果为阴性，表明这种方法成功模拟自然界中含诺如病毒的贝类，对于成功染毒的生蚝标本，该方法可检测出阳性结果，而对于没有吸附在生蚝组织上且没有进行正确富集的病毒，PCR检测结果为阴性，证明这种方法可用于检测贝类中诺如病毒。

3 结论

本文从核酸提取、MCE-PEG富集和贝类中诺如病毒检测3个方面进行诺如病毒检测技术研究，结果表明，采用Trizol法、硅胶柱法和磁珠法提取诺如病毒，结果显示硅胶柱法提取核酸的CT值最小，核酸浓度最大。可见，硅胶柱法提取核酸效果较好，因而本试验采用了硅胶柱法。采用MCE-PEG富集法富集水中诺如病毒，当病毒悬液稀释到10-5时，仍能用该法成功富集到水中诺如病毒，可见其富集效果有效，且操作简便，适合基层实验室作为监测方法。采用实时荧光PCR技术检测染上诺如病毒后的生蚝肠腺组织和蚝腮，与对照组比较，染毒后的生蚝肠腺组织和蚝腮均能检出病毒，结果证明这种方法可用于检测贝类中诺如病毒的试验中。综上所述，硅胶柱法是这3种方法中提取核酸效果较好的；MCE-PEG法富集水中诺如病毒有效；实时荧光PCR技术能检测出染毒贝类中的诺如病毒。

4 参考文献

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