蓖麻基因组DNA提取方法研究进展

风兰 李国瑞 黄凤兰 白英俊 李孟建 孙佳欣 韩雯毓 陈永胜

摘要 目前，基因组DNA的提取已有多种方法，但是不同的方法具有各自的优缺点。本文介绍了蓖麻基因组DNA提取原理，并叙述了近年来提取蓖麻基因组DNA的主要方法，如CTAB法、SDS法、试剂盒法、磁性微球法，通过比较这些不同提取方法的优缺点，分析了影响DNA纯度的因素，如样本的采集与保存、提取缓冲液成分的作用、DNA提取纯化方法等，以期为蓖麻相关研究提供理论基础。

关键词 蓖麻；基因组DNA；提取方法

中图分类号 S565.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）17-0005-02

Abstract At present，there are many methods for the extraction of genomic DNA，but different methods have their own advantages and disadvantages.In this paper，the principle of plant genomic DNA extraction was introduced，and several main methods of castor genomic DNA extraction in recent years，such as CTAB method，SDS method，kit method and magnetic microsphere method were summarized.The advantages and disadvantages of different methods were compared，and the influencing factors of DNA purity were analyzed，such as sample collection and preservation，the extraction buffer components，and purification methods of DNA，so as to provide theoretical basis for the molecular biology research of castor.

Key words castor；genomic DNA；extraction method

蓖麻（Ricinus communis L.）属于大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻属（Ricinus）油料作物[1]，原产于非洲东部，我国已有逾1 500年的栽培历史，栽培种植区主要集中在华北、东北等地区[2]。蓖麻具有适应性广、综合利用价值高[3]、抗逆性强等特点。随着蓖麻被更多地应用于社会各个生产领域，蓖麻遗传分析等研究也正在迅速发展。利用分子手段辅助蓖麻科研育种，对促进蓖麻产业化发展具有重要意义[4]。

基因组DNA的提取是蓖麻遗传性状分析的基础，同时还关系到蓖麻基因文库建立、PCR、RFLP、RAPD等分子生物学研究。因此，快速获得高质量DNA是保证其下游生物学应用的重要前提。在DNA提取过程中，采样时间、提取方法及纯化技术等因素均对DNA质量有较大影响。目前，常用的蓖麻基因组DNA提取方法为CTAB法[5-8]、SDS法[6，8-9]、磁性微球法[10]以及试剂盒法[11]等。这些方法在原理上大同小异，在DNA提取步骤上主要以组织细胞裂解破碎、释放DNA、去除杂质及纯化DNA等4步为主。本文对现有的蓖麻基因组DNA提取方法进行了比较分析，分别叙述其优缺点，以期为蓖麻分子生物学研究提供理论基础。

1 提取原理

1.1 细胞裂解破碎

一般情况下，在液氮中磨碎植物的组织和细胞。液氮处理后，可以使样品变硬、变脆，更容易裂解；经过液氮的速冷后，对样品进行进一步研磨时可以保证DNA充分、均匀地释放；液氮可以提供一个低温环境，防止DNA被DNA酶降解，从而保证基因组DNA的稳定性。

1.2 DNA释放

细胞核中的DNA通常以DNA-蛋白质复合物（DNP）的形式存在。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴化十六烷三甲基铵（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）等离子型表面活性剂，具有溶解核膜蛋白和细胞膜的作用，使核蛋白解聚，从而游离出DNA。

1.3 蛋白质去除

核酸通常与某些蛋白质结合成复合物，存在于细胞核中。因此，将蛋白质与核酸分离后才能获得核酸。提取DNA过程中，一般使用氯仿∶异戊醇（24∶1，v/v）等使蛋白变性，从而留在有机相或中间相，而DNA则留在水相。在具体操作过程中，可以单独使用氯仿∶异戊醇（24∶1，v/v）[12]，也可以增加氯仿∶异戊醇（24∶1，v/v）的抽提次数[13]。

1.4 次生代谢产物去除

植物细胞中含有大量的次生代谢产物，如多糖、多酚、脂类、色素等[14]。提取DNA时，次级代谢产物与DNA共沉淀形成胶体，难以溶解或产生褐变，从而影响DNA的提取和纯化[15]。一般在提取介质中加入β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗坏血酸等抗氧化劑，可以有效去除次级代谢产物对DNA的影响[16]。

1.5 RNA去除

高质量的DNA应不包含或仅含有非常少的RNA。通常可以用RNase在37 ℃下消化1～2 h，以去除样品中的RNA。

2 提取方法

蓖麻含有丰富的多糖、多酚和色素等大分子物质[8-9]，因此提取蓖麻基因组DNA难度较大。目前，提取蓖麻基因组DNA的主要方法有磁性微球法、试剂盒、SDS法、CTAB法。

2.1 CTAB法

CTAB是一种阳离子去污剂，能溶解细胞膜并与核酸形成复合物。它溶于高盐溶液（0.7 mol/L NaCl），而当盐浓度降低到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB和核酸形成复合物，通过离心可从蛋白质和多糖中分离出来。将CTAB溶解于高盐溶液中，再加入乙醇时核酸形成沉淀，而CTAB溶于乙醇中[17]。

CTAB法最大优点是可以去除酚类和碳水化合物等高分子杂质，在提取早期可获得高含量的DNA，可进一步纯化获得高质量的DNA[18]。但CTAB法耗时较长，同时提取所用试剂均要用原始药品配制，稍有偏差就会影响DNA提取质量。因此，在大量集中提取DNA时建议选用CTAB法。

王亚[6]通过改良CTAB法，从蓖麻叶片中提取DNA，具体方法：一是将溶解后的DNA加入RNase A去除RNA；二是在提取过程中加入β-巯基乙醇，有效去除酚类物质；三是利用氯仿∶异戊醇（24∶1，v/v）抽提，去除蛋白质，进一步对粗提物进行纯化。改良的CTAB法得到的蓖麻基因组DNA纯度和质量较高，蛋白质等杂质去除的较干净。经琼脂糖凝胶电泳检测，获得的DNA条带整齐，亮度高，无拖尾。

2.2 SDS法

SDS是一种阴离子去污剂，可在高盐条件下溶解细胞膜以及使蛋白质变性。SDS与核酸形成复合物，通过离心与多糖、蛋白质等大分子物质分开。加入乙醇时SDS溶解于乙醇中，核酸形成沉淀。采用SDS法提取蓖麻基因组DNA操作简便，费用低廉。

黄文霞等[9]采用了改进的SDS法从蓖麻叶中提取DNA。具体的改进方法如下：一是采用新鲜叶片，在常温下用石英砂快速研磨至粉末状，并迅速转移到含有PVP和β-巯基乙醇的SDS提取液中，从而有效避免了褐变；二是在用氯仿：异戊醇（24∶1，v/v）提取之前，增加一次离心步骤，并用低浓度NaAc沉淀DNA，最后得到较纯的DNA。经琼脂糖凝胶电泳检测，得到的DNA条带较亮，无明显的模带。

2.3 试剂盒法

提取蓖麻基因组DNA，也可以用通用的植物基因组DNA提取试剂盒来提取。试剂盒厂家不同，提取步骤也稍有差异。目前用于植物基因组DNA提取的试剂盒普及广泛，如北京索莱宝科技有限公司、北京庄盟国际生物基因科技有限公司等。

一般情况下，通过试剂盒提取的DNA浓度较高，质量较好，且提取耗时少（一般1～2 h），基本上不再需要酚、氯仿等对人体有害的有机溶剂。因此，在试验材料较少或试验要求DNA质量较高时建议选用试剂盒法。但试剂盒法较其他方法成本高，是限制其应用的重要因素之一。

黄凤兰等[11]利用DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取蓖麻叶片DNA并对其提取步骤进行了改良优化。在原试剂盒的操作基础上，消化时间调整为50 min、用冰预冷乙醇、将材料用量改为100 mg、使用60 μL洗脱液后，最终获得了较高质量的蓖麻基因组DNA。

2.4 磁性微球法

磁性微球的原理是在NaCl和聚乙二醇（PEG）溶液中，DNA分子团聚成球形，其磷酸基团能通过氢键与硅包覆磁性微球表面的羟基结合，从而吸附到硅包覆磁性微球表面，与其他蛋白质等大分子物质分离开来，然后用外加磁场从样品溶液中分离出载有核酸的磁性微球。经过适当的清洗去除PEG和NaCl时，DNA分子从磁性微球表面脱附，得到纯化的DNA。

磁性微球法不需要使用有毒化学试剂、操作简单、提取率高、周期短，且得到的样品纯度高。

王雅凡等[10]采用溶剂热方法合成Fe3O4磁性微球，在其表面进行硅包覆，将其应用于蓖麻叶DNA提取，最后得到了高质量的DNA。

3 蓖麻基因组DNA纯度的影响因素

3.1 材料选择

植物组织的选取对基因组DNA的提取有很大影响。健康、幼嫩、处于分裂旺盛阶段的植物叶片细胞，含有更完整的DNA和较少的代谢物。因此，提取基因组DNA时尽量选择新鲜、幼嫩的叶片。

3.2 材料保存

采集蓖麻叶片后，立刻置于液氮中进行冷冻保存，并且运回实验室后应尽快提取基因组DNA。或者从液氮中取出后直接放入-80 ℃超低温冰箱中，可长期保存样品。

3.3 基因组DNA提取过程

3.3.1 离心过程。离心强度要适中。离心强度过强时，可能会导致沉淀重新溶解困难；而如果转速不够或者时间过短时，产生的叶绿素、蛋白质等杂质过多。

3.3.2 水浴过程。水浴过程中，不能采用机械振荡方式，应采用摇晃法混匀，否则会影响DNA提取的效果。

3.3.3 研磨过程。研磨方法和速度等是影响基因组DNA提取纯度的重要因素。必须将蓖麻材料在液氮速冷的条件下快速研磨，同时要控制研磨速度，保证提取的DNA含量和纯度更高。在加入提取液之前必须保持冷冻状态，否则会影响DNA提取的质量。

3.4 基因组DNA提取条件

3.4.1 温度。基因提取过程中，如果温度太高（超过15 ℃），DNA可能会断裂。因此，提取过程应尽可能在低温下进行。在夏季高温时，可在冰浴条件下进行DNA的提取。水浴时间对DNA的提取效果也有一定的影响。水浴保温是为了在高温（65 ℃）下钝化内源性核酸酶的活性，一般为30～60 min[19]。

3.4.2 机械强度。机械强度越大，DNA分子越容易发生断裂。因此，在提取过程中要操作轻缓柔和，同时尽量避免溶液反复转移和剧烈震荡[19]。在转移DNA溶液时可以剪去枪头的尖部，吸取时尽量避免因反复吸打而产生气泡[20]。

4 结语

基因组DNA的提取是蓖麻分子生物学研究的基础，只有在获得高质量基因组DNA时，才能更好地进行后续的相关试验[21-22]。近年来，在农作物中对蓖麻的研究逐漸增多，对其基因组的探究也越来越深入。因此，在蓖麻分子生物学领域的研究中，基因组DNA提取方法的改良尤为重要。对蓖麻已有的4种基因组DNA提取方法比较而言，如果要求DNA质量较高时建议选择试剂盒法；而大量集中提取DNA且DNA质量要求不高时，这4种方法都可以，但在经济条件允许的情况下还是建议优先选择试剂盒法，因为该方法耗时短、操作简单且易获得高质量DNA。在后续研究中，无论是选择哪种方法，仍然需要进一步优化，可从试剂的选择、材料处理、药品浓度和操作次数等多个方面进行优化，从而找出一种最适合的蓖麻基因组DNA提取方法。

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