剪切力对成纤维细胞中p38和CREB活性影响和作用机制

赖俊媚 叶祥明 林敬阳 周盼盼 张利 张劼 李厥宝

剪切力（shear stress）是指血流作用于血管壁单位面积的力。剪切力在动脉粥样硬化、炎症等疾病中扮演重要的角色[1]。研究发现各种内外因素常使外膜成纤维细胞暴露于剪切力作用下[2]，而激活的成纤维细胞是动脉粥样硬化早期事件之一[3-4]。剪切力作用下的成纤维细胞触发下游信号转导，而p38信号持续激活参与动脉粥样硬化发病[5-7]。环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）提高小鼠动脉硬化模型中血管炎症[8]，并介导血管平滑肌细胞增殖和分化[9-10]。剪切力可以同时激活ROS和钙离子[11]。本实验将成纤维细胞置于不同速度、作用时间的剪切力下，并使用不同信号通路抑制剂处理细胞，观察剪切力作用下p38和CREB活性变化以及ROS和钙离子的介导机制，旨在了解剪切力作用下成纤维细胞的信号转导机制，为动脉硬化的发病机制和治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 成纤维细胞（IMR-90）购于上海细胞库，细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM。实验前细胞先饥饿处理（即不含有胎牛血清的细胞培养液）12h。钙离子螯合剂氨基苯乙烷四乙酸（BAPTA）购于德国Millipore公司（产品货号196419-25MG），溶于水制备成10mg/L的母液；过氧化氢酶（Catalase）购于美国Sigma公司（产品货号C1345），溶于磷酸盐缓冲液（PBS） 制备成 100U/ml。Antiphosopho-p38（产品货号 4511），Anti-p38（产品货号8690），Anti-phosopho-CREB（产品货号 9196），Anti-CREB（产品货号 9197），Anti-β-actin（产品货号3700）5种抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司。

图1 剪切力作用对成纤维细胞中p38、CREB信号通路活性的影响[细胞分别使用不同的剪切力（2.5和5dyn/cm2）处理0和30min后使用免疫印迹检测p-p38，p-CREB，p38，CREB，β-actin的表达水平。A：具有代表性的免疫印迹条带；B、C：各组之间相对增加量。与相同剪切力0min相比，*P＜0.05]

1.2 剪切力装置以及分组 成纤维细胞培养在培养皿内，使用STREX细胞机械牵拉仪器置于细胞皿中间，避免触到培养皿底部，对成纤维细胞进行不同持续时间和强度的剪切力作用，然后收集细胞。实验一分别用2.5dyn/cm2和5dyn/cm2剪切力处理细胞0和30min。实验二将分别使用不同作用时间（0、10、30min）和强度（0、2.5、5、7dyn/cm2）的剪切力作用于成纤维细胞。实验三分成两组，一组分别为空白对照、使用Catalase和BAPTA（5和30μmol/L）后加载剪切力，另一组为空白对照，使用Catalase和BAPTA（5和30μmol/L）处理细胞后不加载剪切力。

1.3 蛋白提取 吸走孔板中的细胞培养液，用PBS漂洗细胞后加上细胞裂解液（60mmol/L，Tris-HCl，pH6.8，5%甘油，2%SDS），离心后煮沸 5min，用 BCA试剂盒（购于碧云天生物技术研究所，产品货号P0009）测定蛋白浓度。

1.4 免疫印迹分析 测定浓度的蛋白用SDSPAGE分离胶分离和转印，与一抗在4℃孵育过夜，在室温下再与二抗结合1h，漂洗后与发光底物（购于Cell Signaling Technology公司）结合，放入曝光盒胶片曝光，最后显影、定影。免疫印迹结果经过3次重复。

1.5 统计学处理 采用Predictive Analytics Software 18.0（PASW，version 18.0）统计软件，测得计量资料采用表示，多组间比较采用单因素方差分析（Dunnett’s test），两两比较采用 t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 剪切力作用对成纤维细胞中p38、CREB信号

通路活性的影响 见图1。

由图1可见，免疫印迹显示，在剪切力作用30min后，与2.5dyn/cm2相比，5dyn/cm2剪切力作用下p38、CREB的磷酸化水平明显升高（均P＜0.05）。

2.2 不同作用时间和强度的剪切力对成纤维细胞中p38和CREB的活性的影响 见图2。

由图2可见，免疫印迹分别检测结果显示，在5dyn/cm2剪切力处理10min时，p38和CREB磷酸化水平开始升高，30min时p38磷酸化水平和CREB活性继续逐步升高（均P＜0.05）。在不同强度剪切力作用下处理30min后，免疫印迹检测结果显示，p38和CREB的磷酸化水平在5dyn/cm2和7dyn/cm2均出现明显升高（均P＜0.05）。

图2 不同作用时间和强度的剪切力对成纤维细胞中p38和CREB的活性的影响[A-C：剪切力处理细胞0、10和30min后，采用免疫印迹的方法检测 p-p38、p38、p-CREB、CREB、β-actin 的表达水平；D-F：采用 0，2.5，5，7dyn/cm24 种强度剪切力处理细胞后免疫印迹检测p-p38、p38、p-CREB、CREB、β-actin 的表达水平。与剪切力 0min相比，*P＜0.05]

2.3 清除ROS和Ca2+对剪切力诱导的p38、CREB活性的影响 见图3。

由图3可见，在剪切力作用下，过氧化氢酶处理后p38和CREB的磷酸化水平较未处理组均降低（均P＜0.05）；但用BAPTA处理后，p38和CREB的磷酸化水平较未处理组均升高（均P＜0.05）。在不加载剪切力组，分别以5、30μmol/L BAPTA处理细胞后，p38和CREB的磷酸化水平较未处理组明显升高，且呈剂量依赖性（均P＜0.05）；过氧化氢酶处理细胞后p38和CREB的磷酸化水平较未处理组无明显下降。

3 讨论

在动脉粥样硬化等心脑血管疾病的进程中，剪切力是最主要的危险因素[12]。暴露在剪切力下内皮细胞，通过细胞感受器感受血流剪切力变化，这种机械力通过激活某些信号通路调节不同基因和蛋白质表达，影响血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的结构和功能；同时血管损伤等情况下可以使平滑肌细胞和成纤维细胞直接暴露在剪切力作用下，参与血管重塑和疾病的发生[2]。剪切力作用下可激活MAPK、Ca2+、NOS、Akt等信号通路[1]。在图 1 中剪切力激活成纤维细胞中p38和CREB，这和已发表的一些研究相一致[13-16]。在人牙周膜细胞[13]及在血管内皮细胞中[14]，剪切力可激活p38；在人成纤维细胞中剪切力可使CREB的磷酸化水平升高[15]。剪切力这种正向调控p38和CREB活性呈时间和强度依赖性。图2中显示随着剪切力作用强度增加和作用时间延长，CREB的活性越高；而p38在刺激作用 5、7dyn/cm2时激活强度一致。这说明CREB和p38对于剪切力的感知能力不同，剪切力作用30min，5dyn/cm2时p38已被完全激活，而CREB需要更强的刺激才可完全激活。目前已有许多研究表明，激活的p38能够介导动脉粥样硬化过程中细胞氧化应激、增殖、分化、迁移以及炎症介质的产生[16-18]；激活的CREB能够介导血管外膜成纤维细胞的表型转换[19]，在动脉粥样硬化模型小鼠中CREB介导了白血素-17a的生产和炎症[20]。

图3 在成纤维细胞中抑制ROS和Ca2+后对p38和CREB的活性影响 [A-C：使用250U/L过氧化氢酶和30μmol/L BAPTA预处理细胞30min后免疫印迹的方法检测p-p38、p-CREB、p38、CREB、β-actin的表达水平。D-F：在没有剪切力作用下，使用5和30μmol/L BAPTA处理细胞 30min 后检测 p-p38、p-CREB、p38、CREB、β-actin 的表达水平。B-C：组间比较，*P＜0.05；E-F：与对照组比较，*P＜0.05]

ROS被认为是参与包括高血压和动脉粥样硬化等疾病的病理生理过程[21-22]；图3中用抗氧化剂Catalase清除ROS后，剪切力在成纤维细胞中能够正向调控p38和CREB活性的作用被抑制。说明剪切力对p38和CREB的激活部分依赖于ROS介导。血管平滑肌细胞中诸如亚油酸、oxLDL及其代谢产物等产生活性氧可激活p38和ERK[22]，在内皮细胞中剪切力可通过增加ROS产生来激活p38[23]，与本研究结果相一致。在无剪切力作用下Catalase清除ROS后，p38和CREB活性可见轻微下降趋势，但无统计学差异，可能和样本量少有关。有意思的是，不同于其他研究[24-26]，我们发现用钙离子螯合剂BAPTA清除钙离子，反而使剪切力作用下的p38和CREB活性升高。同时我们发现，在无剪切力作用下，BAPTA同样激活了p38和CREB，并且呈现剂量依赖性。这说明即使在无剪切力作用下，钙离子仍如同刹车一般控制着p38和CREB的活性。有研究表明，在动脉粥样硬化过程中，成纤维细胞可具有分化表型，成为病变血管中异常增生的平滑肌细胞的来源。为了进一步探讨激活p38和CREB的下一步生物学效应，我们检测了成纤维细胞的分化标志蛋白质α-actin，calponin和SM22α，仅见收缩蛋白SM22α轻度升高（实验数据未发表），这可能和剪切力作用强度小也有一定关系。所以在本研究中剪切力是否通过p38和CREB途径影响成纤维细胞增殖、分化以及迁移等生物学效应需要进一步研究。

综上所述，本实验初步证实了剪切力通过诱导产生ROS激活p38、CREB，随着剪切力作用时间延长和强度增加，p38及CREB的磷酸化水平逐渐升高。由于p38和CREB升高和动脉粥样硬化过程相关，推测剪切力可以通过p38和CREB途径引起动脉粥样硬化。另外，我们首次发现抑制钙离子可以使p38和CREB活性增强，从侧面推测生理水平的钙离子可能对血管存在保护作用。本研究对于后续研究剪切力在成纤维细胞中的作用以及了解成纤维细胞参与动脉粥样硬化疾病发生中扮演的重要角色具有一定实际意义，更为下一步研发药物提供了理论依据。