氧化再生纤维素止血产品的体外降解研究

【作 者】陈海波，方丽，喻炎，马凤森

1 浙江省医疗器械检验研究院，杭州市，310018 2 浙江工业大学药学院，生物制剂与材料实验室，杭州市，310014

0 引言

随着可吸收生物材料的蓬勃发展，越来越多的生物医用可降解材料进入人们的视野，大体包括纤维素类、壳聚糖、透明质酸、淀粉、海藻酸盐等多糖与胶原等天然高分子材料，脂肪聚酯、聚原酸酯、聚碳酸酯、生物合成聚酯等合成高分子材料，以及生物陶瓷、生物医用金属材料等[1-3]。其中，纤维素类因其来源广泛，可在体内降解吸收，生物相容性好，广泛应用于药物缓释载体[4]、医疗器械[5-6]及组织工程[7-8]等医药领域。

天然纤维素材料强度高，难以被大多数有机体所消化，但纤维素经再生或改性处理后，稳定的结构被破坏，可被生物体吸收[9-11]。氧化再生纤维素产品用于手术过程中当常规止血方法无效时，用来辅助毛细血管、静脉及小动脉的止血[12]。但氧化再生纤维素在临床应用中，不完全吸收和过敏反应等不良反应[13-14]时有发生。

目前，氧化再生纤维素产品的报道多集中在体内及临床应用方面。本研究选取上市产品速即纱作为研究对象，报道了一种采用凝胶色谱法测定降解产物分子量的变化[15-16]，监控速即纱降解过程的方法，为氧化再生纤维素产品的降解终点的判断提供新的思路。同时建立了采用亲水作用液相色谱（HILIC）与蒸发光散射检测器（ELSD）联用分析降解产物含量的方法[17]，为氧化再生纤维素类产品的降解产物研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 仪器

所用仪器为：Waters 1525液相色谱仪，包括在线真空脱气机，四元泵自动进样系统（美国Waters公司）；Waters 2414示差折光检测器（美国Waters公司）；Nicolet 6700 傅立叶变换红外光谱仪（美国热电尼高力公司）；S-4700 扫描电子显微镜（日本日立公司）；FA1604S电子微量天平(上海天平仪器厂）；FreeZone 6冷冻干燥机（Labconco，美国）；Aglient 1260色谱系统（美国安捷伦公司）；Alltech 3300 ELSD（美国奥泰公司）。

1.2 试剂

所用试剂为：速即纱（规格7.5 cm×10 cm，美国强生公司）；透析袋（美国Viskase）；葡聚糖标准品（美国聚合物标准品公司）；注射级无水葡萄糖（潍坊盛泰药业有限公司）；D-葡萄糖醛酸（aladdin®）；D-纤维二糖（aladdin®）；30%过氧化氢（永华化学科技有限公司）；甲酸铵（江苏永华精细化学品有限公司）；硝酸钠（上海振欣试剂厂）；乙腈（TEDIA®）；甲酸（江苏彤晟化学试剂有限公司）。

1.3 材料降解及降解产物的冻干

取速即纱可吸收止血纱布（约0.50 g），装入煮沸处理的透析袋内，向透析袋内加入现配的3%过氧化氢溶液，排除气泡。将上述透析袋分别放入含有120 mL 3%过氧化氢溶液的烧杯内，置于恒温震荡箱中（37 ℃、100 rpm），每48 h以100 mL新配制的3%过氧化氢溶液更换烧杯内相同体积的溶液[18]。待到设定时间点后，将烧杯内降解液冷冻干燥，得降解产物冻干粉；将透析袋内残留降解物取出，冷冻干燥，得残留速即纱降解物冻干物。

1.4 氧化再生纤维素降解前后结构形态表征

1.4.1 红外光谱分析

将速即纱和降解第4 d后透析袋内的残留速即纱降解物冻干物，分别剪碎后与KBr混合、研磨、压片，得测试样品[19]。在扫描范围为0～4 000 cm-1，采用Nicolet 6700 型FT-IR光谱仪分析降解前后的结构变化。

1.4.2 扫描电子显微镜观察

取速即纱及速即纱的纤维丝，分别用导电胶粘在铝箔圆形载物片上；透析袋内降解物的冻干产物，研磨成粉末撒在导电胶上，用洗耳球吹扫掉导电胶上未粘紧的粉末。将上述制备样品置于铝箔圆形载物片上，喷金5 min，放入扫描电子显微镜中扫描[20]。

1.5 降解产物分子量分析

1.5.1 GPC标准曲线的绘制

以葡聚糖标准品（峰尖分子量为Mp=180 D，3 400 D，20 400 D，36 700 D，55 600 D，81 000 D）做为标样，以峰尖分子量log(Mw)和淋出体积V绘制标准曲线。

1.5.2 降解产物分子量测定

取第4 d、6 d、8 d、10 d、12 d的透析袋内样品，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，测定不同降解时间点的分子量信息。

1.6 降解产物的含量分析

1.6.1 溶液配制

葡萄糖对照溶液配制：精密称取葡萄糖0.010 28 g，加10 mL纯化水溶解，用乙腈定容至50 mL，即得。

纤维二糖对照溶液配制：精密称取纤维二糖0.010 16 g，加10 mL纯化水溶解，用乙腈定容至50 mL，即得。

葡萄糖醛酸对照溶液配制：精密称取葡萄糖醛酸0.010 40 g，加10 mL纯化水溶解，用乙腈定容至50 mL，即得。

样品溶液配制：精密称取降解产物冻干粉0.100 88 g，加2 mL纯化水溶解，用乙腈定容至10 mL，即得。

所有进样溶液均经0.45 μm有机膜过滤。

1.6.2 色谱条件[21]

色谱柱，XAmide（4.6 mm×250 mm，P/N 19170510525，S/N 13070108V）；ELSD漂移管温度，45 ℃；增益，1；氮气流速，1.5 L/min；流动相，有机相-水相（乙腈-pH 5.5的5 mmol/L甲酸铵缓冲液）；流速，1 mL/min；柱温，30 ℃；色谱工作站，ChemStation。

1.6.3 标准曲线的绘制

以葡萄糖对照溶液、纤维二糖对照溶液、葡萄糖醛酸对照溶液进样不同体积，以进样量的自然对数与峰面积的自然对数求得线性方程。

1.6.4 葡萄糖、纤维二糖与葡萄糖醛的含量测定

分别将对照溶液及样品溶液进样20 μL，测定样品中的葡萄糖、纤维二糖与葡萄糖醛酸。

2 结果

2.1 GPC标准曲线

按方法“1.5.1”所述，绘制标准曲线，得到标定曲线方程：log(Mw)=S-2.35V+0.168V2-0.005 34V3，R=0.999 993。

2.2 GPC分析降解产物的分子量信息

第4 d、6 d、8 d、10 d、12 d的透析袋内降解液的分子量信息，如表1所示。

从表1中数据可以看出，随着时间的变化，透析袋内降解产物的分子量（除了Mw）呈现下降趋势，在第10 d、和第12 d时变化趋于平稳，下降趋势呈现平台期，可以推断出速即纱在该条件下的完全降解时间约为10～12 d。

表 1 不同时间点降解产物的分子量信息，n=3Tab.1 The molecular weight of degradation products at diあerent time，n=3

2.3 氧化再生纤维素降解前后结构形态表征

2.3.1 红外光谱分析

对比图1中a、b对应的红外谱图可以看出，降解前的样品和降解后的红外谱图并无较大差异，只有几个单元发生了变化。可能的原因是：3%过氧化氢溶液的氧化作用较弱，材料的降解主要是高分子链的断裂，聚合物没有产生新的结构，或已发生轻微的结构变化但尚未达到红外光谱的检测限；关于3%的双氧水溶液对纤维素中单体的结构影响以及降解产物种类和含量尚需进一步研究与分析。

2.3.2 扫描电子显微镜观察

由图2～图4可知，速即纱可吸收止血纱布降解前，纤维表面较为光滑，纤维的编织结构完整，没有纤维断裂的现象（图2、图3）；速即纱可吸收止血纱布经过降解后，纤维的整体编织结构完全破坏，说明透析袋外的降解产物完全，并且表面有腐蚀的小孔结构（图4）。表明该类材料随着降解过程的发生，表面形态发生很大变化。

2.4 降解产物中葡萄糖、纤维二糖与葡萄糖醛酸的含量测定

由表2可知，氧化再生纤维素产品的降解产物中存在葡萄糖与纤维二糖，但含量比较低，其中葡萄糖含量为0.13%，纤维二糖含量为0.17%。而在当前检测条件下样品中没有检测到葡萄糖醛酸，可能是由于在该降解条件下氧化再生纤维素降解生成其他可溶性的寡聚糖。

图2 速即纱降解前纤维表面电镜照片Fig.2 SEM images of fiber surface before degradation of SURGICEL

图3 速即纱降解前织物编织结构Fig.3 SEM images of braided structure before degradation of SURGICEL

图4 速即纱降解产物表面结构Fig.4 SEM images of braided structure after degradation of SURGICEL

3 讨论

（1）扫描电镜多用于检测样品的形貌和组成，扫描电镜结果发现降解前后表面形态发生较大变化，但降解前后的红外谱图却并无明显差异。分析原因可能是：在3%过氧化氢溶液的氧化环境下，降解主要是高分子链的断裂，官能团结构并没有发生较大变化。

表2 降解产物中葡萄糖、纤维二糖和葡萄糖醛酸的含量，n=3Tab.2 The content of glucose, fiber disaccharide and glucuronic acid in degradation products，n=3

（2）目前，用来判断氧化再生纤维素的降解终点，一般采用目测法和失重法[22]，而本研究通过采用GPC测定不同降解时间时降解产物的分子量变化[23-24]，测定速即纱的降解终点为10 d，该结果也与梅昕等[19]研究结果一致。

（3）HILIC对强极性物质有更大保留，适于分析单糖、二糖和低聚糖[25]，而ELSD对不挥发的溶质灵敏度高，也适于分析糖类[26]。氧化再生纤维素的最终降解产物中的葡萄糖含量为0.13%，纤维二糖含量为0.17%。

（4）氧化再生纤维素在降解过程初始阶段，发生高分子链的断裂，随着降解不断进行，降解产物逐渐变为不同分子量的葡聚糖[27]，并最终降解为葡萄糖及其衍生物。氧化再生纤维素降解终点判断，其降解产物组分的分子量分布位于Mp 3 000～13 000之间。因此，其组分为平均聚合度在19～67之间的葡聚糖，而氧化再生纤维素的最终降解产物则含有小分子的葡萄糖和纤维二糖。

4 结论

本研究通过氧化再生纤维素的降解产物分析，确证了其最终降解产物含有葡萄糖和纤维二糖。同时还建立了一种新的判断氧化再生纤维素的降解终点的方法，也为可吸收类产品的降解终点判断提供新的选择和参考。