髓样分化因子88在结直肠癌患者癌组织中的表达及其临床意义

朱广伟，郑 炜，黄永建，华 进，杨树钢，叶建新

(福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区 福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室，福建 福州 350005)

髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)信号通路中的关键分子[1-2]。MyD88是Toll样受体信号通路中重要的接头蛋白，在TLRs信号通路中处于节点位置和关键点，调控信号通路下游因子的活化，从而启动免疫反应，且与多种疾病的发生有关联[3-4]。研究[4-6]表明：MyD88不仅在免疫性疾病中具有重要作用，在炎症性等疾病的发展中也具有重要作用。近年来研究[7-8]显示：MyD88在多种肿瘤的发生发展和侵袭中发挥重要的作用。但仅有少量报道关于MyD88在结直肠癌组织中的表达[9]。为了进一步探讨MyD88与结直肠癌及其预后的关系，本研究通过检测结直肠癌患者癌组织中MyD88的表达，分析其与患者临床参数之间的关系，以期为结直肠癌的治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 主要试剂和仪器 DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥公司，即用型UltraSensitive SP试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司，MyD88抗体购于美国Affinity生物公司。隔水式恒温烤箱GNP-9080购于上海精宏实验设备有限公司，组织切片机AS325购于英国Shandon公司，光学显微镜DM4000B购于德国Leica公司。

1.2 临床资料 选择2010年3月—2011年3月在福建医科大学附属第一医院胃肠外科接受手术治疗并经过病理证实的结直肠癌患者90例，年龄28～83岁，平均年龄(61.0±11.6)岁。本组研究对象均在入院时签署知情同意书，知晓其肿瘤组织标本和临床病理资料用于科学研究。研究对象每隔3个月经电话或者门诊随访，本研究经本院伦理委员会批准。

1.3 免疫组织化学染色 取术中切除的新鲜结直肠癌肿瘤组织标本和癌远旁正常结直肠组织标本(距离肿瘤大于8 cm)，经甲醛固定，行常规石蜡包埋后备用。石蜡标本行4 μm厚度连续切片，将石蜡切片脱蜡、水化，抗原修复暴露抗原决定簇，3%H2O2去离子水孵育25 min，PBS冲洗，去除PBS后，加入鼠抗人MyD88抗体50 μL后，4℃过夜；复温后去除PBS，加入即用型UltraSensitive S-P试剂盒，PBS冲洗后加新鲜配置的DAB底物液，显微镜下观察4～6 min，掌握染色时间，自来水冲洗。苏木素复染1～3 min，自来水、双蒸水洗5 min，PBS返蓝5 min，脱水、透明、中性树胶封片。

免疫组织化学的染色结果评估采用Image-Pro Plus 6.0软件(美国Media Cybernetics公司)。每组随机抽出15张切片，每片随机选择3个视野，每组共45个视野，使用软件计算每个视野的平均吸光度(A)值，即积分A值(IA)/阳性面积，半定量MyD88的表达情况。

2 结 果

2.1 MyD88蛋白在结直肠癌患者癌组织和癌远旁组织中的表达水平 MyD88在结直肠癌患者癌远旁组织中的表达水平为0.165 4±0.142 6，明显低于MyD88在结直肠癌组织中的表达水平(0.387 9±0.182 6，P<0.01)。见图1(插页五)。

2.2 不同临床病理参数结直肠癌患者结直肠癌组织中MyD88的表达水平 结直肠癌组织中MyD88的表达水平与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤大小和组织学分化无关联(P>0.05)。MyD88在结直肠癌组织中的表达水平：Ⅰ-Ⅱ期患者明显低于Ⅲ-Ⅳ期患者(P<0.05)，T1-T2期患者明显低于T3-T4期患者(P<0.05)，M0患者明显低于M1患者(P<0.05)，无淋巴转移患者明显低于有淋巴转移患者(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床病理参数结直肠癌患者癌组织中MyD88蛋白表达水平

Tab.1 Expression levels of MyD88 in cancer tissue of colorectal cancer patients with different clinicopathological parameters

Clinicopathological parameternMyD88 expression t/FPAge (year) <60 ≥60 33570.254 7±0.069 8 0.295 7±0.102 9 0.1020.867Gender Male Female59310.321 9±0.087 1 0.369 7±0.161 1 0.8060.467Tumor size (cm) ≤3 >338520.354 2±0.124 5 0.372 6±0.098 6 1.0460.330Clinical stage Ⅰ-Ⅱ Ⅲ-Ⅳ21690.216 5±0.139 7 0.357 4±0.162 1 2.5410.003T stage T1-T2 T3-T430600.214 6±0.165 8 0.392 5±0.191 1 2.0750.039M stage M0 M18190.319 4±0.196 5 0.419 6±0.165 72.0730.041Lymph node metastasis No Yes43470.289 7±0.117 5 0.396 4±0.162 3 2.3860.023Histological differentiation Low 230.395 6±0.196 5 Mild 420.368 9±0.202 10.3770.095 High 250.312 0±0.189 5

2.3 MyD88表达水平与结直肠癌患者临床预后的关系 以90例患者结直肠癌组织MyD88表达水平均数(0.326 5)为准，MyD88高表达组34例，低表达组56例。Kaplan-Meier法生存分析结果显示：MyD88高表达组结直肠癌患者的生存率明显低于低表达组(P<0.05)。见图2。

*P<0.05 compared with low MyD88 group.

Fig.2 Survival curves of patients with colorectal cancer

3 讨 论

MyD88基因主要在免疫细胞中表达，包括T细胞、B细胞和单核细胞等。蛋白结构研究显示：MyD88的分子结构包含C端Toll样受体和白细胞介素1受体相关结构域(TLR/IL-1R related domain,TIR)和N端结构域，与死亡结构域相似，可与其他具有死亡结构域的蛋白相互作用；另外，MyD88也存在中间结构域，可与IL-1相关受体激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK)相互作用，介导TLR信号的传导，激活下游基因的转录[10]。在哺乳动物的先天免疫中MyD88发挥重要的作用，是激活先天免疫反应的基本因子[11]。

MyD88发挥功能调控细胞生物学行为调控的重要因子是核因子κB(NF-κB)和活化蛋白1(AP-1)，其是重要的细胞信号转导因子，调控各种基因的转录表达从而发挥生物学功能，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)和干扰素β(INF-β)等[12-13]。MyD88通过对多种信号通路的调控，在免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生发展过程中均发挥重要作用[14-15]。

MyD88在结直肠癌组织中的表达及与结直肠癌患者预后的关系，目前研究报道较少。杜永生[16]研究显示：MyD88 mRNA在结直肠癌组织中的表达水平降低，且与患者的性别、年龄、分化程度、肿瘤直径、癌胚抗原(CEA)、有无淋巴转移、浸润程度、分布部位和Duke’s分期无关。秦艳等[17]研究显示：MyD88在结直肠癌组织中的表达水平升高，且组织异型性越大，表达水平越高，MyD88在正常黏膜、增生性息肉、腺瘤和腺癌组织中的表达水平逐渐升高。于月红等[18]研究显示：结直肠癌组织中MyD88 mRNA表达水平明显升高，低分化癌组织中MyD88 mRNA表达水平最高，临床分期越晚MyD88 mRNA表达水平越高。另外，Wang 等[9]发现：MyD88在结直肠癌组织中呈高表达，且肝转移患者MyD88表达水平更高；MyD88高表达的结直肠癌患者预后差，是结直肠癌患者预后的独立危险因素。由此可见，到目前为止MyD88在结直肠癌组织中的表达及临床意义尚无定论，需要进一步的研究。

本研究结果显示：MyD88在结直肠癌患者癌远旁组织中的表达水平明显低于结直肠癌组织，表明MyD88在结直肠癌组织中的表达水平增加。杜永生等[16]发现：结直肠癌组织中MyD88 mRNA表达水平降低，且与患者各临床病理因素无关。另外，于月红等[18]报道：结直肠癌患者癌组织中的mRNA表达水平明显升高，低分化癌组织中MyD88 mRNA表达水平最高，且临床分期越晚，MyD88 mRNA表达水平越高。这种完全不一致的报道，可能是因为mRNA检测的误差，也可能是因为样本量的问题；另外，mRNA的检测不能反映MyD88蛋白在结直肠癌组织的表达情况，免疫组织化学检测蛋白表达水平具有更好的优势，因为mRNA表达水平高，不一定蛋白的表达水平高。

秦艳等[17]虽然检测了MyD88在结直肠癌组织中表达的情况，也揭示出从腺瘤到癌组织中MyD88 表达的明显差异，但是并未分析MyD88在结直肠癌中的表达与患者预后的关系。本研究显示：MyD88 高表达的结直肠癌患者生存率明显降低；且临床病理参数分析显示：MyD88的表达水平与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤大小和组织学分化无关，与患者的临床分期、T分期、M分期和淋巴结转移状态有关，提示MyD88高表达水平促进了结直肠癌的进展。

关于MyD88在结直肠癌中的作用，本课题组正在进行下一步研究，如MyD88和肿瘤化疗耐药性的问题。另外，本课题组将进一步研究MyD88在结直肠癌发生发展中发挥的作用，为结直肠癌的临床治疗提供理论依据。