液相色谱-串联质谱法测定蜂产品中20种喹诺酮类药物的残留量

彭丽 ，吴宁鹏，方忠意，舒畅，杜红鸽，朱雷

(河南省兽药饲料监察所，郑州 450008)

我国是养蜂大国，蜂蜜产量和出口量均居世界第一[1]，随着养蜂产业化的发展，兽药在防治蜂病、降低蜜蜂死亡率、提高蜂产品产量方面起到了重要作用。喹诺酮类药物系化学合成药物，由于价格低廉，具有广谱、高效、低毒以及与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点，在蜜蜂养殖产业中，广泛用于预防和治疗可引起蜜蜂幼仔大量死亡的美国或欧盟污仔病。喹诺酮类药物在其广泛应用的同时亦存在着不少问题，过量或不当使用会导致药物残留，除其本身的毒副作用对人体造成直接危害外，更为严重的是人类长期食用含较低浓度喹诺酮类药物的蜂产品，容易诱导耐药性的传递，从而影响该类药物的临床疗效。因此，蜂产品中喹诺酮类药物残留问题越来越受到人们的重视。目前，蜂产品中喹诺酮类药物的检测方法主要有：薄层色谱法[2-3]、高效液相色谱法[4-7]和液质联用检测法[8-15]等,其中液质联用技术由于选择性和灵敏度较高，应用最为广泛。由于蜂王浆样品基质非常复杂，目前的检测方法多是仅针对蜂蜜样品，涉及蜂王浆样品的也多是采用QuEChERS方法[8-10]进行净化，检测限较高，药物种类较少，难以满足实际样品检测的需要。本文采用固相萃取方法作为净化方法，结合液相色谱-串联质谱联用技术，建立了同时测定蜂蜜和蜂王浆中20种喹诺酮类药物残留量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 超高效液相色谱-串联质谱仪(Waters公司)；XP205分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，SIGMA 3-30K离心机(德国SIGMA公司)；KQ-3200E超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；N-EVAP-112氮吹仪(美国Organomation)；MS3 basic涡旋混合器(IKA)。恶喹酸、氟甲喹、西诺沙星、二氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、萘啶酸、依诺沙星、达氟沙星、麻保沙星、氟罗沙星、加替沙星、奥比沙星、吡哌酸和司帕沙星标准品对照品，含量均大于91.1%，购于Dr. Ehrenstorfer公司；Waters Oasis HLB 固相萃取柱(6mL/500mg)；Whatman玻璃纤维滤纸(1.6 μm)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯)；氨水、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙酸乙酯(分析纯)；实验用水为经Milli-Q净化系统制备的去离子水。提取液：称取磷酸氢二钠7.16 g和磷酸二氢钠3.12 g，加入800 mL水溶解，用磷酸调节pH至3.0±0.5，再用水定容至1000 mL。20%乙腈甲酸溶液：取乙腈20 mL，用0.1%甲酸溶液定容至100 mL。

1.2 标准溶液的配制 精密称取喹诺酮类对照品各10 mg，分别于10 mL量瓶中，用少量氨水溶解后，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准贮备液。-20 ℃保存，有效期6个月。

1.3 样品前处理

1.3.1 蜂蜜 称取试料 (2±0.02) g，于50 mL聚丙烯离心管中。加提取液20 mL，涡旋1 min，振荡10 min，10000 r/min离心5 min，取上清液，备用。

1.3.2 蜂王浆 称取试料 (2±0.02) g，于50 mL聚丙烯离心管中。加提取液10 mL，涡旋1 min，振荡10 min，10000 r/min离心5 min，取上清液。残渣加提取液10 mL重复提取，合并两次上清液，玻璃纤维滤纸过滤后，备用。

1.3.3 净化 固相萃取柱分别用甲醇10 mL、水10 mL活化，取备用液过柱，用水5 mL淋洗，抽干，分别用5%甲酸甲醇4 mL和乙酸乙酯4 mL洗脱，收集洗脱液，于40 ℃氮气吹干。用20%乙腈甲酸溶液1.0 mL溶解残余物，超声1 min后涡旋混匀，20000 r/min离心5 min，上清液滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 液相色谱参考条件 色谱柱：Waters UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速0.30 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 μL；流动相A相为甲醇，B相为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序：0～1.5 min，5%～20%A；1.5～4.5 min，20%～40%A；4.5～6.5 min，40 %～95%A；6.5～7.5 min，95%A；7.5～8.0，95%～5%A；8.0～9.0 min，5%A。

1.4.2 质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测(MRM)；电离电压1.0 kV；源温150 ℃；雾化温度500 ℃；锥孔气流速150 L/h；雾化气流速1000 L/h；定性离子对、定量离子对及对应的碰撞能量参考值见表1。

表1 20种喹诺酮类药物的分子式、保留时间和质谱参数Tab 1 Molecular formula, retention time and MS parameters of 20 quinolones

*定量离子

1.5 定性测定 在同样测试条件下，试样液中喹诺酮类药物的保留时间与基质匹配标准溶液中喹诺酮类药物的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的标准溶液相对丰度一致，其允许偏差应不大于±30%。

2 结果与分析

2.1 线性范围 精密量取喹诺酮类药物混合标准工作液适量，用20%乙腈甲酸溶液稀释，配制成浓度为1、2、5、10、20、50 ng/mL的系列标准溶液，各取1.0 mL，分别于6个经提取、净化吹干步骤处理的空白试料中，溶解残余物，20000 r/min离心5 min，上清液过滤，供液相色谱-串联质谱测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制基质标准曲线。蜂蜜和蜂王浆基质中各药物的回归方程及相关系数见表2。从表中可以看出，药物在1～50 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性相关，喹诺酮类药物蜂王浆基质标准溶液特征离子色谱图如图1所示。

2.2 方法的灵敏度 添加适量混合标准溶液于2 g空白样品中，经提取后测定，依据信噪比S/N>3(按PtP算)，确定检出限为0.5 μg/kg。依据信噪比S/N>10(按PtP算)，确定定量限为1.0 μg/kg。

2.3 方法的准确度和精密度考察 采用标准添加法，在空白蜂蜜、蜂王浆中添加1.0、2.0、5.0 μg/kg 3个不同浓度，进行准确度和精密度试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差，计算结果见表2。从表中可以看出，本方法在空白蜂蜜和蜂王浆中进行1～5 μg/kg的添加，平均回收率在69.0%～105.1%之间，相对标准偏差均小于14.7%。说明该方法对蜂蜜和蜂王浆中喹诺酮类药物不同含量的测定均有较好的准确度和精密度。

表2 20种药物的相关系数、回收率及相对标准偏差Tab 2 Correlation coefficients, recovers and RSDs of 20 quinolones in bee products

添加浓度单位为μg/kg

3 讨论与结论

3.1 仪器条件的优化 将一定浓度的喹诺酮类标准溶液流动注射进样，发现这些药物的[M+H]+峰均比较强，故选择[M+H]+作为母离子。喹诺酮类药物因分子中含有羧基和哌嗪结构，子离子主要为脱羧峰[M+H-CO2]+和脱羧后哌嗪环断裂重排[M+H-CO2-C2H4NR ]+。选择丰度最强的碎片离子作为定量离子，次强的碎片离子作为定性离子。由于喹诺酮类药物均为两性物质，色谱峰易出现拖尾现象。采用0.1%甲酸水溶液作为流动相的组成部分，可以增加化合物的离子化效率，使检测的灵敏度迅速提高，并且20种药物均能得到对称、尖锐的峰形。

3.2 净化条件的确定 喹诺酮类药物中含有羧基和叔氨基，具有酸碱两性性质，参考文献及药物性质，用标准溶液对Waters HLB柱[11、14]、Agilent C18柱、混合型阴离子交换柱[12](Agilent PAX柱)、混合型阳离子交换柱(Waters MCX柱、Agela PCX柱)和强阳离子交换柱(Supelco SCX)进行考察。结果显示C18柱和HLB柱对所有药物都有很好的保留，回收率均在85%以上。PAX柱除了恶喹酸、诺氟沙星和依诺沙星回收率约为75%，其余药物回收率均超过85%。阳离子交换柱结果均不理想，原因可能是阳离子交换柱对部分药物的吸附作用太强。对蜂蜜和蜂王浆基质进行考察，发现二者差异较大。蜂王浆由于成分极为复杂，采用PAX柱进行净化时，药物在固相萃取柱上的损失很大，方法回收率达不到30%，可能是蜂王浆中的王浆酸等酸性物质在阴离子交换柱上的竞争结合导致。C18柱上大部分药物有很好的回收，但恩诺沙星、吡哌酸回收率不到60%，相比之下HLB柱拥有更高更稳定的回收率。最终选择HLB柱作为净化柱。

1-洛美沙星(352.11 > 265.06)；2-培氟沙星(334.12 > 290.10)；3-环丙沙星(332.10 > 231.01)；4-依诺沙星(321.16 > 303.10);5-诺氟沙星(320.10 > 233.04)；6-吡哌酸(303.97 > 189.05)；7-西诺沙星(263.03> 188.98)； 8-氟甲喹(262.05 > 202.00)；9-恶喹酸(262.03 > 159.98)；10-萘啶酸(233.05 > 214.98)；11-二氟沙星(400.11> 356.07)；12-奥比沙星(396.18 > 352.13)；13-司帕沙星(393.01 > 349.08)；14-沙拉沙星(386.09 > 299.02)15-加替沙星(376.19 > 261.10)；16-氟罗沙星(370.16 > 326.16)；17-马波沙星(363.17 > 72.05)； 18-氧氟沙星(362.11 > 261.07)；19-恩诺沙星(360.13 > 316.10)；20-达氟沙星(358.18 > 340.13)图1 喹诺酮类药物蜂王浆基质标准溶液特征离子色谱图(2 ng/mL)Fig 1 Chromatogram of quinolones in matrix standard (2 ng/mL)

3.3 提取条件的确定 提取溶液不仅影响药物的提取效率，同时也会对药物在固相萃取柱上的保留产生影响。喹诺酮类药物中含有羧基和叔氨基，具有酸碱两性性质，易溶于酸性和碱性溶液。比较了pH分别为1、3、6和10的溶液作为提取液时的回收率，发现喹诺酮类药物采用pH=3的溶液回收率最高。由于蜂王浆样品只能部分溶于提取液，形成悬浊液，仅进行一次提取部分药物回收率不理想。经过考察，最终采用20 mL分两次对蜂王浆进行提取。提取液高速离心后依然浑浊，需要采用玻璃纤维滤纸过滤后才能过固相萃取柱净化。

该方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度，适用于蜂产品中20种喹诺酮类药物的残留量的测定。