复凝聚法制备焦酚缓释微囊工艺优化

（河南师范大学水产学院，水产动物疾病控制河南省工程实验室，河南省水产动物养殖工程技术研究中心，河南新乡453007）

我国淡水因水体富营养化和有害蓝细菌水华造成的污染问题日益严重，导致生态环境失衡，已成为全球严重的环境问题之一[1]。目前，控藻的主要方法有物理、化学和生物法[2]。但这三类方法还存在一些不足之处，其中物理技术成本较高，化学技术生态安全性差，生物技术适用性不足等。

化感作用是指植物或微生物释放代谢产物对环境中其他植物或微生物产生有利或不利影响[3]。胡利静等[4]介绍了具化感作用的水生植物和陆生植物种类，并从细胞膜透性、光合作用以及细胞内酶活性响应三个方面阐述化感物质抑藻的作用机理。沈冰洁等[5]从藻细胞光合作用、细胞膜的响应等方面来探究植物化感抑藻机理，并比较分析了从水生植物和陆生植物中获得的各种化感抑藻物质的抑藻效果。马来眼子菜、黑藻和苦草对蓝藻具有显著抑制作用，黄新颖等[6]对马来眼子菜、黑藻和苦草三种沉水植物体内抑藻活性物质做了检测分析。植物源活性物质是一类来自植物机体的次生代谢产物，目前已筛选出的具有抑藻活性的植物源物质以黄酮、酚酸和萜类等类别物质为主[7]。Nakai等[8-9]研究发现狐尾藻分泌的多酚化合物能抑制蓝藻生长，并且进一步证明其中含有焦酚等多种物质。刘碧云等[10]发现焦酚对铜绿微囊藻、水华鱼腥藻等藻类的生长有不同程度影响，但在碱性条件或二价或三价金属离子存在下，焦酚能进行自氧化。现已发现的植物源活性抑藻物质，生态安全性高，容易降解，但直接施用却容易受复杂水环境影响出现局部浓度过高、有效成分流失、药效持续时间短等问题。

缓释剂是一种减缓药物释放速率从而延长药效的制剂。缓释常用的方法有微胶囊技术和化学键合等[11]。缓释微囊的囊壁由高分子材料构成，是通过多种方法将另一种物质包含在内而形成的具有控制囊内物质释放过程的半透膜微胶囊[12]。海藻酸盐、壳聚糖和明胶等是常用的天然高分子材料[13]。常用的微胶囊技术有流化床包埋法和凝聚法等[14]。其中复凝聚法是指使用两种带相反电荷的高分子材料作为囊壁，在一定条件下交联且与囊芯物质发生凝聚以形成微胶囊从而将囊芯物质包覆[15]。

因此，本文采用壳聚糖-海藻酸钠为囊材的复凝聚法制备焦酚缓释控藻剂，并对制备工艺进行优化，以期为高效生态安全的藻华防治技术提供思路。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂包括壳聚糖（粘度50-800 mPa.s）、海藻酸钠 （粘度 （10g/L，20℃） /（Pa.s） ≥0.02）、焦酚、冰醋酸、二甲亚砜（DMSO）等。

主要仪器包括JTCQ系列固相萃取仪、DK-8D型电热恒温水槽、玻璃砂芯过滤装置、真空干燥锅、氮吹仪、5 mL注射器、培养皿、MS2-P1H磁力搅拌器、研钵、TG16-WS台式高速离心机和多功能指数分析仪等。

1.2 焦酚缓释微囊制备流程

首先，配制体积分数为1%的乙酸溶液，加入一定量壳聚糖，搅匀之后加入无水氯化钙，在56℃水浴锅中搅拌溶解至完全呈乳液，此溶液为体系1。其次，量取适量蒸馏水，添加海藻酸钠，在56℃水浴锅中搅拌溶解至粘稠状，配制成海藻酸钠溶液，根据囊芯浓度，相应地称取焦酚并量取DMSO，然后将焦酚-DMSO混合溶液与海藻酸钠溶液混合，制成体系2。最后，将体系1的壳聚糖、冰醋酸和无水氯化钙混合溶液配制好后，放在磁力搅拌器上，然后加入转子，50℃600 rpm/min搅动，按体系2与体系1体积比为1∶10取体系2焦酚-DMSO-海藻酸钠的混合溶液，用注射器逐滴滴加到体系1中，滴加完毕后再继续搅动反应30 min后将反应后的微囊悬浊液过47 mm的微孔滤膜，然后转移至干净培养皿上，放入真空干燥锅内，在真空干燥锅底部加入变色硅胶，然后抽真空，静置在真空环境中让其干燥。

1.3 微囊特性检测

1.3.1 形态观察

每一批微囊定量总体系体积、囊芯物质质量和微囊干重，相同容器、相同角度观察每一种微囊形态。

1.3.2 残留液内焦酚含量的测定

在JTCQ系列固相萃取仪上插上萃取小柱，然后每个萃取柱按顺序依次加入丙酮、甲醇和蒸馏水活化平衡，1 mL残留液过柱后加蒸馏水淋洗，15 min抽干，然后加入丙酮洗脱，洗脱液放在氮吹仪上吹干，吹干后加入正己烷重悬浮，然后转移到棕色GC进样瓶中，BSTFA衍生化，GC分析。

1.3.3 缓释微囊内焦酚含量的测定

称取5 mg微囊，放入研钵中研磨碎，加入丙酮对囊芯中的物质进行浸提，超声30 min，8000 rpm离心10 min，之后取上清滤液1 mL氮吹，吹干后正己烷重悬浮，转移至1.5 mL GC进样瓶，BSTFA衍生后GC分析，根据标线换算得到5 mg微囊内焦酚质量。

1.3.4 包埋率计算

包埋率=A/B×100%（A为微囊中焦酚实测含量，B为添加到微囊中的焦酚含量）

1.4 微囊制备工艺优化

1.4.1 囊材最佳配比

配制海藻酸钠溶液25 mL和壳聚糖溶液50 mL，两者的质量分数均为0.2%，在600 rpm/min 50℃条件下按比例将壳聚糖溶液加入到海藻酸钠溶液中，用Tintometer Group多指数分析仪实时测定混合溶液电导率。考虑到壳聚糖溶液溶胀和不溶胀可能存在差异[16]，同时比较了壳聚糖溶胀12 h组和未溶胀组的囊材最佳配比。

1.4.2 不同囊芯浓度对微囊特性的影响

制备不同囊芯浓度的焦酚缓释微囊，焦酚在体系2中浓度设置为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL，比较不同浓度下微囊形态和包埋率，同时制作无囊芯的空白微囊作为对照。

1.4.3 不同含量助溶剂DMSO对微囊特性影响

设置最佳囊芯浓度和最佳囊材配比，制备不同DMSO含量（17%、29%、38%、44%、50%） 的焦酚缓释微囊，详细记录制备过程、产品形态以及各体系的状态等，等干燥后测定包埋率。

2 实验结果

2.1 壳聚糖与海藻酸钠最佳含量比

如图1所示，不论壳聚糖是否溶胀，整个实验反应过程中电导率的变化趋势基本一致。当壳聚糖与海藻酸钠的比值0.5时，曲线发生转折，这点说明溶液中所含离子量最少，也就是说，当比值为0.5时，正负电荷结合最充分，是复凝聚反应的最佳比例。

图1 溶液电导率随壳聚糖与海藻酸钠混合比例变化曲线Fig.1 The conductivity change curves of mixed solution of chitosan and sodium alginate at different proportions

2.2 不同焦酚添加量制备微囊特性比较

根据先前描述的微囊制备步骤，制备1-5 mg/mL的焦酚微囊，拍照记录刚制备出的微囊形态，如图2所示，1-3 mg/mL的微囊形态呈球形，4-5 mg/mL的微囊形态大部分呈球形，但大小不均匀。微囊干燥后称重，1-3 mg/mL的微囊总干重较重，而4-5 mg/mL的微囊总干重相对较轻。由图3的结果可以得出，不同囊芯浓度微囊的包埋率中，3 mg/mL和4 mg/mL微囊包埋率较高，其余囊芯浓度的微囊包埋率相对较低。综合包埋率、微囊形态和微囊总干重三个指标可以得出，3 mg/mL为制作微囊的最佳浓度。

图2 不同囊芯浓度焦酚微囊形态Fig.2 Form of pyrogallol microcapsules with different core concentrations

图3 不同囊芯浓度微囊包埋率Fig.3 The embedding rate of pyrogallol microcapsules with different core concentrations

2.3 不同DMSO含量制备微囊特性比较

在微囊制备过程中发现DMSO含量对微囊形态会有影响，固定囊芯物质浓度为3 mg/mL，设置一系列的DMSO含量梯度（17%、29%、38%、44%、50%），制备焦酚微囊，由图4可见，不同DMSO含量的微囊都能成球形，DMSO含量升高，微囊色泽会变暗。由图5可见，DMSO含量为17%和44%的微囊包埋率较高。当DMSO含量为29%和38%时，微囊的总干重较重，DMSO含量为17%、44%和50%时，微囊的总干重之间相差不大。综合包埋率、微囊形态、微囊色泽以及微囊总干重等指标的结果，并从节约成本的角度考虑，我们认为17%为制作3 mg/mL微囊的DMSO最佳含量。

图4 不同DMSO含量焦酚微囊形态Fig.4 Form of pyrogallol microcapsules with different DMSO content

图5 不同DMSO含量焦酚微囊包埋率Fig.5 The embedding rate of pyrogallol microcapsules with different DMSO content

3 讨论

倪利晓等[17]发明了以壳聚糖和海藻酸钠为囊材，以亚油酸为囊芯的缓释抑藻剂，在微囊制备工艺中添加乳化剂和交联剂，并进行抑藻测试，实验结果显示，亚油酸缓释抑藻剂对铜绿微囊藻具有明显的抑制作用，但未对缓释抑藻剂的包埋率进行检测。黄皓旻等[18]发明了囊芯为黄酮，囊材为壳聚糖和海藻酸钠，包埋率为50-70%的缓释抑藻剂，在微囊制备过程中将pH调到最适并对制备的微囊进行常规藻类抑制实验，发现缓释微囊具有明显的抑藻活性。本研究首次以沉水植物穗花狐尾藻化感物质焦酚为囊芯，采用复凝聚法成功制备焦酚缓释微囊，探究了囊材的最佳配比并从囊芯物质浓度、助溶剂DMSO含量两个方面优化制备工艺，初步证明复凝聚法可以用于研发基于简单酚类抑藻物质的缓释控藻制剂。

本文首先探究了囊材最佳配比，壳聚糖加入到海藻酸钠溶液中后，海藻酸钠的-COO-与壳聚糖上的-NH3+产生静电作用，溶液中所含的带电离子数量逐渐减少，曲线的拐点也即是最低点所对应的比值为0.5，当比值大于0.5时，电导率又逐渐上升是因为在比值为0.5时壳聚糖与海藻酸钠反应完全，如果向溶液中再添加壳聚糖溶液就会使溶液中的壳聚糖含量过多，这时候测得的电导率就接近于壳聚糖溶液的电导率。综上所述，壳聚糖与海藻酸钠的复凝聚反应最佳比例为1∶2。

实验过程中还采用福林酚法检测了反应滤液中的总酚含量（未发表数据），较GC法测得焦酚含量高，暗示在制备焦酚缓释微囊的过程中，焦酚仍发生了自氧化，导致一部分焦酚以自氧化产物的形式存在于滤液中。由此推测，缓释微囊中囊芯物质除了焦酚，也应该有一部分自氧化产物。Nakai等（1999）的研究结果显示，焦酚自氧化产物具有较强的抑藻效果[9]，那么，含有自氧化产物的焦酚缓释微囊控藻效果如何，有待进一步研究。另外，因为壳聚糖和海藻酸钠都带有电荷，溶液的pH可能对反应会有所影响，所以需要优化复凝聚反应的pH。