斑点叉尾鮰套肠症温和气单胞菌的分离鉴定及药敏研究

黄立新， 刘 熹

（1.郑州市金水区农业农村工作委员会，河南郑州 450000；2.河南省水产技术推广站，河南郑州450008）

斑点叉尾鮰（Ictalurus Punctatus） 属于鲶形目鮰科，原产于美国，体形较长，体表光滑无鳞，背部呈浅灰色，腹部呈乳白色，身体两侧有不规则浅黑色小点，尾鳍分叉较深。头部有触须4对，有脂鳍，属于广温性鱼类。我国的斑点叉尾鮰是在1984年从美国引进的，经过后期的驯养和推广，已在我国多个省、市、区广泛养殖。随着水产养殖业高密度、集约化养殖，养殖环境日益恶化，鱼类细菌性疾病逐年增多，使水产养殖业的经济损失严重。据报道，引起斑点叉尾鮰感染细菌性疾病主要有套肠症[1]、肠道败血症[2]、暴发性败血症[3]、腹水病[4]等，斑点叉尾鮰套肠症是较为严重的细菌性疾病，具有发病快、死亡率高的特点。近3年，我们对河南省内斑点叉尾鮰养殖区域进行流行病学调查，发现斑点叉尾鮰肠道疾病尤其是套肠症发病严重。

本研究以发病典型的患病鱼为实验对象，对其病原菌进行分离鉴定，并研究致病菌对常用抗菌药物的敏感性，为斑点叉尾鮰套肠症的研究及防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

病样为河南省郑州荥阳养殖池塘的患病斑点叉尾鮰。健康斑点叉尾鮰，规格为：体长（16.5±10）cm，体重（39±5） g，取自湖北良种繁育基地，试验前在消毒水簇箱内暂养一周，确认无病后用作后续试验。

1.2 试剂

药敏纸片购自杭州天和微生物技术有限公司，LB（Luria-Bertani）培养基和MH（Mueller-Hinton）培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司，API-20E为法国梅里埃公司生产。2×ES Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司。细菌DNA提取试剂盒均购自北京天根生物公司。

1.3 病原菌的分离培养

取发病典型症状的斑点叉尾鮰，在无菌条件下，从病鱼肝、肾、脾和腹水等取样，划线接种于LB琼脂培养基上，28℃培养24 h后，挑取形态一致的优势菌进行纯化养，将纯化的菌株再转接LB液体培养基中过夜培养，加25%的甘油-20℃保存备用。

1.4 攻毒试验

挑纯化的单菌落接种于LB液体培养基中，28℃恒温培养18～20 h，离心弃上清，用无菌生理盐水洗涤菌体，采用比浊法和细菌计数方法将菌悬液稀释至1.0×108cfu/mL，依次十倍梯度稀释至1.0×107cfu/mL、1.0×106cfu/mL、1.0×105cfu/mL、1.0×104cfu/mL。取暂养一周后的健康斑点叉尾鮰腹腔注射菌悬液，每组注射10尾，注射量为每尾0.2 mL，空白对照组注射0.2 mL的无菌生理盐水。在24～30℃水温下饲养，连续观察15 d，记录鱼的死亡数量及发病症状。

1.5 菌株的鉴定

1.5.1 API-20E生化鉴定

采用API-20E细菌鉴定系统，按照鉴定系统对应的产品说明书对病原菌进行生化鉴定。同时进行接触酶、氧化酶、V-P和葡萄糖氧化发酵试验。

1.5.2 16S rRNA基因分子鉴定

将菌株接种于5 mL的LB液体培养基中，以28℃、180 rpm振荡培养12 h，12000 rpm离心3 min弃上清获取菌体。按照DNA试剂盒说明书提取细菌DNA，-20℃保存。采用16S rRNA基因[5]进行PCR 扩 增 ： F∶5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R∶5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，反应体系(20μL)：2×ES Taq Master Mix 10μL，上下游引物各 0.8μL，DNA模板 1μL，用双蒸水补足至20μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃终延伸10min。

1.6 药敏试验

蘸取纯化的细菌培养物于LB液体培养基中过夜培养，将生长至对数生长期的菌液调至0.5麦氏比浊管浓度，吸100ul均匀涂布于MH平板上，等距离贴上药敏纸片，28℃恒温培养24 h，测量抑菌圈直径的大小，根据药敏纸片说明书判定耐药（R）、敏感（S）或中度敏感（I）。

2 结果

2.1 患病鱼临床症状

患病斑点叉尾鮰游动缓慢、食欲减退，体表充血、出血并出现大小不等的脱色斑；肛门外突、发红，后肠段的一部分脱出到肛门外，腹部膨大；腹腔内有淡黄色腹水，肠道中后段出现肠套叠，肝脏肿大，颜色变淡发白或呈土黄色。患鱼的肝脏出现出血斑，质地变脆，脾、肾出现肿大现象。

2.2 细菌形态

从患典型套肠症的斑点叉尾鮰肝脏中分离到一株优势菌，暂命名为ZX-1。菌株ZX-1在LB琼脂培养基上，呈现圆形、表面湿润、中央微凸、边缘光滑整齐的单菌落，革兰氏染色阴性、短杆状，直径在 1～2.5mm。

2.3 攻毒试验结果

采取腹腔注射的方式进行攻毒试验。结果表明，ZX-1对斑点叉尾鮰有强致病力，采用改良的寇氏法计算菌株的半致死剂量 LD50为3.91×105cfu/mL。发病鱼病症与自然发病鱼症状一致，主要表现为体表充血、出血，肛门红肿、外突，腹腔内有淡黄色腹水，肠道中后段出现肠套叠，肝脏肿大，颜色变淡发白。另外从攻毒感染发病的鱼体中重新分离到的菌株经生化鉴定和分子鉴定表明其与感染用的ZX-1一致，由此可证明该菌株为此次斑点叉尾鮰套肠症的病原菌。

表1 ZX-1 菌株对斑点叉尾鮰攻毒感染试验结果Tab.1 Results of Ictalurus Punctatus infected with strain ZX-1

2.4 菌种鉴定

2.4.1 API-20E生化鉴定

ZX-1菌株的氧化酶阳性，可发酵葡萄糖，不产生H2S，硝酸钾、吲哚、色氨酸、柠檬酸、精氨酸、N-乙酰-葡萄糖胺、甘露糖和V-P试验等阳性，鸟氨酸脱羧酶、脲酶、色氨酸脱羧酶、已二酸、肌醇、山梨醇、密二糖、阿拉伯糖、苦杏仁甙试验均为阴性。API-20E系统鉴定结果见表2。

2.4.2 16S rRNA基因鉴定

PCR扩增ZX-1菌株的16S rRNA基因片段约1500 bp，测序结果表明该片段有 1487 bp，在GenBank中的登陆序列号为AB473013。同源性检索结果表明ZX-1菌株与气单胞菌属的温和气单胞菌核苷酸同源性达99%以上。从NCBI核酸数据库中选取同源性较高的同源性序列，利用MEGA6.0软件建立进化树（图1）。ZX-1与温和气单胞菌菌株AB473013聚成一个分支。

表2 ZX-1菌株的API-20E鉴定结果Tab.2 The identification of strain ZX-1byAPI-20E

图1 ZX-1菌株16S rRNA基因序列进化树Fig.1 The phylogenetic tree of strain ZX-1 based on 16S rRNA sequence

2.5 药敏试验

ZX-1菌株对16种抗菌药物敏感性研究表明，该菌株对氟喹诺酮类药物如氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星敏感，另外对氯霉素、氟苯尼考和复方新诺明敏感；对青霉素、阿莫西林、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、利福平、四环素耐药。

表3 ZX-1菌株对16种抗菌药物的药敏试验Tab.3 Antibiotic sensitivity test of 16 antimicrobial drugs against ZX-1

3 讨论

斑点叉尾鮰是中国主要的淡水经济鱼类，因此肉质上乘、营养丰富等特点受到广大养殖户的青睐。目前，斑点叉尾鮰的细菌性病原菌已报道的有气单胞菌（Aeromonas）、假单胞菌（Pseudomonas）和嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）等[6]，温和气单胞菌可引起多种鱼类患肠道疾病[4]，快速又准确地鉴定出鱼类的这些致病菌，并采取及时有效的防控和治疗措施，对减少水产养殖业的经济损失具有重大意义。

本研究采用快速诊断细菌性疾病的API-20E生化系统进行鉴定，结果显示菌株ZX-1可发酵葡萄糖，不产生H2S，利用硝酸钾、色氨酸、精氨酸、甘露糖等，不利用阿拉伯糖、肌醇、山梨醇等的理化反应与彭亚等[4]的结果一致。但其鼠李糖阳性、山梨醇阴性、阿拉伯糖阴性反应与樊海平等[7]的研究结果不一致。说明相同菌株、理化性质不同，可能与其宿主和其分布的地域等有关。16S rRNA基因作为细菌分类鉴定的分子学方法具有操作简便、灵敏度高、准确性好的特点，故其序列比对已成为首选的分子学技术。本研究中ZX-1的16S rRNA序列与GenBank中的温和气单胞菌AB473013的同源性达99%，并且该菌株与温和气单胞菌AB473013在进化树上聚为一支。根据王海娟等[5]的研究，当细菌的16S rRNA基因同源性在99%以上时，可被认为属于同一种。本研究同时采用传统微生物鉴定和分子鉴定两种方法，从而准确地从发病斑点叉尾鮰中分离鉴定出了温和气单胞菌。

攻毒试验表明，从濒死斑点叉尾鮰中分离到的菌株ZX-1可感染健康斑点叉尾鮰，并对斑点叉尾鮰有较强的致病和致死作用，且发病症状一致，均表现出体表充血、出血，肛门红肿、外突，腹腔内有淡黄色腹水，肠道中后段出现肠套叠，肝脏肿大、颜色变淡发白等症状。从攻毒患病斑点叉尾鮰中分离的细菌经鉴定与ZX-1菌株的生理生化鉴定和分子鉴定结果一致，证明ZX-1为斑点叉尾鮰患套肠症的致病菌。

水产动物养殖过程中常选用抗菌药物对细菌感染进行防治，但是过多使用抗菌药物将导致菌株产生耐药性。经16种抗菌类药物对分离菌的药敏试验，结果显示该菌对喹诺酮类敏感，对氯霉素、氟苯尼考和复方新诺明也敏感；对氨基糖苷类、青霉素类、利福平和四环素耐药。曹海鹏等[8]研究表明，金鱼（Carassius auratus） 源温和气单胞菌对庆大霉素、环丙沙星等高度敏感，对新生霉素、氨苄青霉素等均不敏感，与本文研究结果存在差异。刘洋等[9]分离的细鳞鱼（Brachymystax lenok） 源温和气单胞菌对四环素、庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星等高度敏感，对氯霉素、复方新诺明中度敏感，对红霉素耐药，与本文研究结果存在差异。所以相同菌种但不同来源的菌株的耐药性因宿主或地理环境的不同而存在差异性。根据本研究结果，应及时控制当地对β-内酰胺类、四环素类和氨基糖苷类药物的使用。本研究可为进一步研究温和气单胞菌的耐药机制、监测水产养殖环境和鱼体中细菌的耐药性提供参考。