基于肠道病毒A71型基因组研究其毒力相关位点

李洁 杜轶威 霍达 杨扬 梁志超 贾蕾 陈丽娟 王全意

肠道病毒A71型(EV-A71)具有高度的嗜神经性,感染的病例易出现神经系统症状及并发症,甚至引起死亡［1］。2010—2012年我国实验室确诊的重症病例80%以上由于感染EV-A71所致,手足口死亡病例中有93%以上由EV-A71感染导致［2］。推测EV-A71感染后相关临床症状的差异可能是由于病毒毒力的差异导致。本研究将基于轻症和死亡病例的C4a基因型EV-A71分别从5′UTR区核苷酸及编码蛋白区氨基酸位点进行比较分析,探索研究与重症死亡相关的毒力位点。

1 材料与方法

1.1 材料来源 本研究共对2个来源于咽拭子的EV-A71毒株进行基因组测序,其中1株来源于仅有出疹的轻症手足口病例,1株来源于手足口病死亡病例。此外本研究从GenBank上下载EV-A71基因组序列用于分析。为确保各个序列间具有可比性,仅选用C4a基因型毒株的全基因组序列。为排除由于重症病例诊断标准不同而引起分析结果的偏倚,选用了EV-A71感染导致死亡的基因组序列和轻症的基因组序列。序列入选标准是:在时间、地理位置上接近的死亡病例和轻症病例感染的C4a基因型EV-A71基因组序列。本研究共从GenBank上下载29条导致死亡病例和30条引起手足口病轻症病例的EV-A71全基因组序列(GenBank序列号分别为:MG208882,HQ129932,FJ194964,EU703812,EU703813,EU703814,FJ607337,JF913464,FJ606447,FJ606448,FJ606450,FJ828519,EU864507,JX678875,JX678876,FJ439769,FJ607334,GQ231933,FJ607335,FJ607336,GU366191,JN256059,JN256062,JX244186,GQ994989,GQ994990,GQ994991,JX244182,GQ994992,JX244183,JX244184,JX678880,JX678881,HQ891926,HQ891927,HQ891929,JN864018,JN864019,JN864020,HQ828086,KJ004560,HQ712020,JF830007,KJ004552,KJ004553,KC570453,KF444809,KP198623,KP198624,KJ004554,KJ004555,MF405075,MF431793,KT428644,KT428645,KT428646,KT428647,KT428648,KT428649,KT428650)。增加本研究的1例死亡病例和1例轻症病例基因组序列,一共用于分析的基因组序列为:30条序列来源于EV-A71死亡病例,31条序列来源于轻症病例。

1.2 EV-A71基因组序列扩增、测序 对本研究的2株EV-A71毒株进行基因组扩增:采用 QIAamp viral RNA Minikit(QIAGEN,德国)提取病毒核酸。采用随机引物和Super-ScriptⅡ逆转录酶在42℃对病毒RNA进行逆转录1.5 h。使用9对特异引物对cDNA进行PCR扩增(见表1)。体系配置及反应条件按照试剂盒说明书进行。末端序列测定采用商品化RACE试剂盒(TaKaRa Biomedicals)进行。采用ABI公司的BigDye terminator v3.1 cycle sequencing kit试剂和BigDye X-terminator试剂,应用 ABI3100全自动遗传分析仪进行序列分析,产物使用双向测序。

1.3 基因组序列整理 对于获得的EV-A71基因序列使用 Sequencher4.10.1软件(GeneCode,AnnArbor,Michigan,USA)对每个样本的双向序列进行手动拼接,参照序列峰图进行人工校读,校读完毕后将序列以文本文档的形式保存。

表1 EV-A71基因组序列扩增测序引物Tab.1 Genome amplification sequencing primers of EV-A71

1.4 EV-A71的5′UTR二级结构预测分析 根据脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点第5结构域与其毒力密切相关［3］,EV-A71的5′UTR 的第 453-561碱基与该结构域对应。本研究使用RNAfold软件对本研究的3个EV-A71基因组5′UTR的第5个结构域进行二级结构预测。

1.5 氨基酸残基性质分析 依据氨基酸残基的亲水性、残基大小和化学性质对氨基酸进行分类。依据Kyte and Doolittle［4］的氨基酸亲水性参数将氨基酸分为三类:疏水性氨基酸,中性氨基酸和亲水性氨基酸；依据氨基酸残基的大小分五类:很小、小、中、大、很大；根据氨基酸残基的化学特性,将其分为11类:脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、含羟基氨基酸、酸性氨基酸、酰胺氨基酸、碱性氨基酸和其他5种单独分类的氨基酸。

1.6 基于蛋白晶体结构分析EV-A71的潜在毒力位点 利用Swiss-model同源建模的方法从GenBank上下载已发表的EV-A71蛋白的晶体结构,利用Pymol软件展示各蛋白三维空间结构,标记具有潜在毒力的氨基酸位点。

1.7 统计学方法 采用卡方检验分析EV-A71某位点上的不同氨基酸在轻症和死亡病例分布的差异是否有统计学意义,计算OR值分析氨基酸位点与病毒毒力的相关性。以p＜0.05为差异有统计学意义,数据利用 SPSS(version 19.0,IBM SPSS Statistics)分析。

2 结果

2.1 EV-A71基因组序列同源性分析 通过对1株来源于轻症病例的毒株和1株来源于死亡病例的毒株的VP1(891 bp)序列与EV-A71参考株进行序列比对,本研究的2株EV-A71均属C4a基因型。2个基因组序列的同源性是97.5%,5′UTR区核苷酸同源性为97.9%。P1区核苷酸同源性为98.0%,P2区为96.7%,P3区为97.3%。

2.2 EV-A71的5′UTR区结构预测 对来源于轻症和死亡病例的EV-A71毒株5′UTR的第453-561碱基序列进行二级结构预测［5］,结果显示二者的二级结构完全相同(图1)。

2.3 氨基酸位点分析 将本研究中的EV-A71的编码蛋白区基因经比对后翻译成氨基酸,61条序列氨基酸数目相同,同源性为95.9%。以EV-A71参考株U22521为参照,分析以上序列的氨基酸位点变异。

在EV-A71的结构蛋白区和非结构蛋白区每个氨基酸位点有2条及以上序列不同的纳入χ2检验,同时认为易出现在死亡病例来源的氨基酸为潜在的毒力位点,共获得4个氨基酸位点,各位点在死亡病例和轻症病例的构成比差异具有统计学意义(见表2)。2 A区第68位有精氨酸(R)和蛋氨酸(M)两种氨基酸,分析结果显示死亡病例的该位点更易出现M。2C区的第41位有R和赖氨酸(K),在死亡病例的该位点更易出现R。3 A区的第47位有苏氨酸(T)、缬氨酸(V)和丙氨酸(A),其中1例死亡病例该位点为V,其余24位死亡病例该位点为A,相对于该位点为T的轻症病例。3C区的第158位有V和I两种氨基酸,死亡病例的该位点更易出现V。用2 A区R68 M、2C区K41R、3 A区T47 A及3C区I158 V作为衡量标准,结果显示以上每个氨基酸位点的敏感度分别为86.7%(26/30)、83.3%(25/30)、83.3%(25/30)和 89.3%(27/30)。

图1 RNAfold软件预测EV-A71的5′UTR的第453-561碱基空间结构A:death case,B:mild caseFig.1 Predicted 5′UTR secondary structure of EV-A71 from base 543 to 561 by RNA fold

在GenBank下载与EV-A71的2 A、3A和3C等高度同源的蛋白结构数据(PDB编号分别为:3W95、1ng7、3sjo),其中 3W95 与 2 A 蛋白、1ng7 与3 A蛋白、3sjo与3C蛋白的同源性分别为97.3%、46.55%和98.9%。以本研究死亡病例毒株的2 A、3A及3C等氨基酸序列作为目标序列,利用SWISSModel的同源建模法构建蛋白空间结构,由于未能成功获得与2C蛋白高度同源的蛋白空间结构模板,因此利用I-TASSER软件对2C蛋白进行结构预测。用PyMOL软件进行结果的渲染。结果显示(图2):2 A和3A蛋白均是二聚体结构,2 A的68位、2C的41位及3 A的47位氨基酸残基位于各自蛋白的表面,3C区158位氨基酸残基位于3C蛋白结构的凹陷处。

表2 EV-A71毒株氨基酸编码区的潜在毒力位点分析Tab.2 Analysis of the potential virulence sites of EV-A71 virion amino acid coding regions

图2 Pymol软件呈现的2 A、2C、3 A和3C蛋白Note:Red represents α-helix,green represents β-fold and blue represents random curl.The purple ball represents the 68thresidue on 2 A protein,the 41stresidue on 2C,the 47thresidue on 3 A protein and the 158thresidue on 3C proteinFig.2 Predicted protein structure of 2 A,2C,3 A and 3C with PyMOL software

3 讨论

EV-A71是手足口病的主要病原之一,与其他病原相比,EV-A71相关手足口病具有更高的重症率和死亡率［6］。EV-A71和脊髓灰质炎病毒同属肠道病毒属,文献报道脊髓灰质炎病毒的毒力基因位于5′UTR的第5个结构域,通过对EV-A71进行比对发现来源于轻症和死亡病例的EV-A71该区结构完全相同,不能依据该区的结构判断EV-A71的毒力。

国内外多个研究对EV-A71毒株的潜在毒力位点开展研究,文献报道:EV-A71的VP1145E变异株可引起病毒血症,产生神经病变［7］；VP2(149 M)突变可以提高病毒结合能力,导致小鼠死亡［8］。本研究通过EV-A71氨基酸序列比对,未发现轻症和死亡病例来源的EV-A71在VP1的145位和VP2的149位氨基酸差异有统计学意义。本研究在EVA71的非结构蛋白区共获得4个轻症病例和死亡病例差异具有统计学意义的氨基酸位点。EV-A71的2 A蛋白酶诱导真核细胞起始因子4G(eIF-4G)的裂解,阻止宿主蛋白的合成［9］。研究发现 EV-A71的2 A蛋白酶的63～65,及73位高度保守,与底物结合相关［9］,本研究发现2 A区68位氨基酸位于蛋白空间结构的表面,死亡病例的EV-A71在2 A区68位更易出现M,M是非极性中性氨基酸,轻症病例该位点较易出现R,R是极性带正电荷的碱性氨基酸,推测蛋白质表面氨基酸性质的改变可能导致酶功能的改变。

2C蛋白是一个高度保守的蛋白质,具有ATP酶活性通过招募宿主细胞编码的网状蛋白质3形成复制复合物来参与病毒的复制［10］。本研究结果显示死亡病例EV-A71的2C区41位氨基酸更易出现R,部分轻症病例该位点为K,R和K都是亲水性带正电荷的碱性氨基酸,由于二者均为亲水性氨基酸,推测R和K侧链基团的不同可能影响酶功能。

EV-A71的3 A蛋白有87个氨基酸残基,3 A蛋白可以调节宿主细胞的胞膜内运输。在RNA复制过程中,3 A蛋白通过其疏水区促进囊膜与复制复合体结合以及病毒RNA的合成［11］。本研究发现3 A区47位氨基酸位于具有水溶性的N端,由T变为A,氨基酸发生由中性向疏水性的改变可能会导致二聚体蛋白质结构功能的改变。

EV-A71的3C蛋白酶可以促进病毒复制,抑制宿主细胞转录,与中枢神经系统发病有密切的关系［12］。研究结果显示 Rupintrivir与 EV-A71的3C蛋白酶的第142～147,161～165等等高度保守的氨基酸残基形成的口袋以较高亲和力结合,可导致3C蛋白酶不可逆失活［13］,本研究结果显示死亡病例在3C区158位易出现V,位于口袋内侧,与高度保守位点161位置临近,同位于一个β折叠上。部分轻症病例该位点为I,V和I均是疏水性氨基酸,I较V有更大的疏水侧链,其刚性结构特征及疏水相互作用都对蛋白质折叠有重要的影响力,氨基酸的变化可能导致酶空间结构发生改变对蛋白功能产生影响。

本研究的局限性有两方面:一是本研究中的死亡病例EV-A71序列均在Genbank上获得,在收集尽量多死亡病例序列后依据其地理、年代等信息收集对应的轻症病例序列,但由于死亡病例基因组数量非常有限,研究所选的基因组序列在年代和地理的代表性上有局限性。二是发现的可能的毒力位点仍需更多基因组序列进行毒力位点的验证,需要进行反向遗传学实验和恰当动物模型加以进一步证实。

综上所述,本研究基于EV-A71基因组对引起手足口病的EV-A71进行分析,发现轻症和死亡病例EV-A71的5′UTR核苷酸的第ⅴ区与毒株的毒力不相关,非结构蛋白区部分氨基酸位点的变异可能与C4a基因型的EV-A71的毒力相关。

利益冲突:无