温州市2009—2016年儿童流感监测分析

陈栋 孙宝昌 张严峻 杜垚强 虞成超 吴矛矛 吴可可 郑文力

流行性感冒(influenza)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,起病急、传播快,是严重威胁人类健康的疾病,是WHO实行的第一个全球性监测的传染病［1］。儿童是流感暴发的主要易感人群和传播者［2］,做好儿童流感病例的监测分析对于流感防控工作有着重要意义。温州市2009年加入了全国流感监测网络,是浙江儿童流感的主要监测点,为了解儿童流感流行的特点和流行病学特征,为儿童流感的防控提供依据,本文对2009—2016年8年间流感监测网络中儿童流感监测情况进行分析,结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 对于符合流感样病例者,国家流感哨点医院温州医科大学附属育英儿童医院门急诊就诊的儿童患儿(小于18岁)每周随机采取10—20份病例的鼻咽拭子,以及部分县(市、区)疾病预防控制中心采集的儿童流感样病例样本,冷藏保存,48 h内送至实验室检测。采集样本都征得患儿父母的知情同意和医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 流行病学监测:2009—2016年8年间温州医科大学附属育英儿童医院的儿科门、急诊和(或)发热门诊开展流感样病例监测,每天记录和登记各年龄组的流感样病例数和门急诊病例就诊总数,并将数据录入到“中国流感监测信息系统”,由温州市疾病预防控制中心计算ILI%,作为反映流感流行强度的指标进行分析。

1.2.2 流感病毒核酸检测:流感病毒RNA提取和实时荧光定量PCR检测操作均按照仪器和试剂盒说明书进行。对样品进行核酸提取后,采用实时荧光定量PCR进行流感病毒核酸检测,包括流感甲型通用、H1、H3N2、A(H1N1),乙型(Yamagata/Victoria分型)、禽流感H5N1、H7N9。核酸提取试剂为MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit试剂盒(美国Roche公司),实时荧光定量PCR检测试剂购自上海之江生物科技有限公司和江苏硕世生物有限公司,均有合格批号并都在有效期内使用。

1.2.3 病毒的分离培养和测序:采用鸡胚和MDCK(狗肾细胞)分离培养核酸筛查阳性的流感样本分离病毒,再分别通过甲型、乙型测序引物扩增,由铂尚生物技术(上海)有限公司对扩增产物进行纯化和序列测定。

1.3 数据分析和处理 采用SPSS 21.0版软件进行统计分析。率的差异比较用 χ2检验,p＜0.05为差异有统计学意义。核酸和氨基酸序列比对和突变分析采用Geneious 11.0.4版软件,聚类分析基于核酸测序结果,采用全局比对和Tamura-Nei模型计算遗传距离,系统进化树构建采用Neighbor-Joining方法,Bootstrap值设定为1000。

2 结果

2.1 流行病学监测结果 2009—2016年8年间温州医科大学附属育英儿童医院的门、急诊总数达到10 577 089例,流感样病例(ILI)数共有337 896例,平均ILI就诊比例数为3.19%。2009年,因为A(H1N1)型流感暴发,ILI数全年达到185 475例,平均每月15 456例,ILI%为9.65%,远高于其他年份的月均1 832例,ILI%为1.80%。这8年间出现了两次流行高峰,第1次是2009年的A(H1N1)型流感暴发疫情,全年ILI数达到185 475例,是其他年份的8.78倍,其中1～3月份和7～9月份这两个时间内尤其严重,3月份ILI达到22 234例,8月是29 808例,8月份 ILI%为16.50%,以 A(H1N1)型为主；第2次高峰是2013年12月份到2014年1月份,1月份ILI数达到8 921例,比例达到5.66%,远高于2013年和2014年的平均水平,以乙型流感感染为主,具体见图1。

2.2 儿童流感监测病例检测概况 8年间共检测儿童流感病例标本4 046份,流感阳性511份(阳性率为12.63%),其中2009年流感阳性率最高,为24.19%,2011年阳性率最低,为5.75%,其中流感流行型别中以乙型最多,H3N2型次之,A(H1N1)型随后,H1型最少；流行年份中2009年以A(H1N1)型为主,占55%；2010、2011、2013 以乙型为主,分别占 49.12%、69.23%、65.15%；2014、2015年以H3N2型为主,分别占到43.42%,63.63%。2012年:以乙型和H3N2为主,2016年:乙型、A(H1N1)、H3N2三种型别交替流行,具体见表1。

表1 2009—2016年温州市儿童流感监测结果概况Tab.1 Overview of the monitoring results of children’s influenza in Wenzhou,2009—2016

图1 2009—2016年温州市儿童流感监测流感样病例比例图Fig.1 Proportion of influenza like illness cases of children in Wenzhou,2009-2016

在儿童流感乙型各型别中2015年之前都是以Yamagata亚型为主,2016年则以Victoria亚型占绝大多数,在2009年以前人群中流行的季节性H1流感从2011年HIN1暴发流行后再未检测到,具体各型别构成见图2。

2.3 儿童流感不同性别组检测情况 8年间共检测4 046份儿童流感监测标本中,男性2 388例,阳性305例,阳性率为12.77%,女性 1 658例,阳性206例,阳性率为12.42%。男性儿童患者比女性患者多,但不同性别组人群的流感病毒阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 儿童流感病例各年龄分布 把患儿分为0～3岁、4～6岁、7～9岁、10～12岁、13～15岁,16～18岁6个年龄组,其中0～3岁组流感病例数184人,占比36.01%,样本数为2 278份,样本数和病例数都为最多,最小病例为出生28 d的新生儿,4～6岁次之,随着年龄的增加,各年龄组的人员占比逐渐减少。从阳性率来看,10～12岁组则是最高的,为35.03%,13～15岁组28.33%次之,0～3岁组为8.08%最低。各年龄组阳性率比较,p＜0.01,差异有统计学意义,见表2。

图2 2009—2016年度儿童流感中各型别构成比表Fig.2 Each type of child influenza in 2009-2016 constitutes a specific form

2.5 氨基酸测序差异 对2009—2016年间的甲型和乙型流感病毒毒株HA片段进行了核酸测序,分析氨基酸变异结果发现,得到甲型HA片段7个毒株中共有28个差异突变,其中145位和391位氨基酸在不同年份的毒株中发生3次突变,其余存在多个单株突变；乙型HA片段Yamagata型7个毒株中共有42个差异突变,不同年份毒株的突变类型存在差异；乙型HA片段Victoria型5个毒株中有3个差异突变。参考序列毒株为:A/California/07/2009(H1N1)、B/Massachusetts/02/2012(Yamagata)、B/Anhui Hefei Baohe/1257/2010(victoria)。

2.6 流感病毒HA片段系统进化分析 基于HA基因序列进行不同流感毒株的系统进化分析。结果显示甲型流感在进化上亲缘关系很近,2009—2011年毒株序列变异很小。乙型流感在进化上分为Yamagata和 Victoria两个进化分支,其中毒株2011—2012年属于Victoria型,其它年份的毒株属于Yamagata型,说明温州乙型流感两个亚型交替流行,互占优势。从进化树上可以看出Yamagata型又进一步区分为Y1和Y2个分支,其中2019—2010年与2015—2016年毒株位于Y1分支,但是序列存在变异,2012—2014毒株位于Y2分支,见图3。

表2 2009—2016年度各年龄组儿童流感病例统计表Tab.2 Statistics of children′s influenza in all age groups,2009-2016

图3 温州市甲型和乙型流感病毒HA基因序列系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the HA gene sequences of influenza viruses A and B in Wenzhou city

3 讨论

我国是流感高发国家,儿童是流感的主要发患者群,在流感流行季节,超过40%的学龄前儿童和30%的学龄儿童患病［2-3］,2009—2016年8年间温州市儿童哨点医院共收集4 046份儿童标本的监测结果,流感病毒阳性检出率5.75% ～24.19%,平均12.63%,儿童流感病毒流行以冬春季(12月份至来年3月份)高发,A3和A(H1N1)高发的时候,夏季(8月份～9月份)偶尔伴有小高峰流行,其中1月份是流行高峰,易出现学校、幼儿园等集体单位的局部暴发。而男女性流感病毒阳性率差异无统计学意义,与国内其他研究结果相一致［2,4］。在儿童流感流行中以乙型最多,H3N2型次之,A(H1N1)型随后,与成人流感A(H1N1)高于H3N2不同,在儿童流行型别中H3N2比A(H1N1)多,分析其主要原因是儿童对各个流感型别都没有免疫力,普遍易感,所以,对儿童来说在2009年暴发时A(H1N1)型的比例也没有成人高。学校暴发多起乙型流感疫情［5-6］,而且近几年乙型流感感染明显增多,有多例6个月内婴幼儿感染乙型流感,最小流感患者为新生儿,与当地乙型流感变异、气候环境、易感人群变化是否有关,值得进一步研究。

据国外及我国多省份的监测报道［7-8］,0～4岁是流感发病最多的人群,本研究监测的6个年龄组中,0～3岁组ILI就诊人数和病例数最多,说明该年龄组人群年龄小,免疫力低,又大部分在早教托幼机构很容易受到感染,不仅是流感病毒还包括如副流感病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒等病原体感染,6月龄内的婴幼儿感染增加需重点关注。10～12岁组流感阳性率为35.03%最高,而7～9岁,13～15岁组阳性率也高达20%以上,远高于其他年龄组,差异有统计学意义,与其他地方报道结果相一致［3,7］,这与少年儿童是流感的易感人群有关,同时,该年龄段儿童处于入学年龄,高度聚集,冬春季节教室通风不好,一旦出现流感病例,在教室和宿舍的密闭环境中易于引起传播。因此,根据流感冬春高发的流行规律,做好在校学生的流感预防宣传教育,做好日常生活的各项防范措施,加强对此类人群的主动监测,特别是加大学龄前和学龄儿童的流感疫苗接种力度是预防流感的重要措施［9］。

通过对氨基酸突变差异进行分析,本研究发现不同年份HA甲型流感的不同毒株的单个突变差异较大,其中E391 K突变使A(H1N1)型进化成两个分支,带有S202T突变在2010年以后成为主要分支,并持续到现在［10］。 145、155、158、159、189 等部位氨基酸一般认为是流感病毒与受体结合的部位,而P145S和S155 N的突变影响流感病毒受体结合力,导致宿主对病毒更加易感［11］。HA乙型Yamagata 和 Victoria 型 具 有一定相似 性［12］,B/Wenzhou/1300/2013毒株就是通过氨基酸序列和聚类分析结合NIC复核确认属于乙型Yamagata型。乙型Yamagata型较为复杂,且发生率较高［6,12］,随年份变化存在较多的差异突变,聚类树分析其中可能存在进一步的亚型Y1、Y2,说明温州地区乙型流感基因型比较复杂。以后要加强乙型流感的监测,加强不同基因型相互转换与乙型流感的关系研究。通过核酸测序分析突变差异和亚型分类能有效提高流感病毒的精确鉴定,对流感的预防和控制具有广泛的应用价值。

利益冲突:无