不同严重程度冠心病患者外周血Treg和Th17细胞的测定

杨 兵，林爱琴，罗晓华，刘莉萍

1)郑州铁路职业技术学院护理学院内科护理教研室 郑州 451460 2)郑州大学第五附属医院心血管内科 郑州 450052

冠心病是由动脉粥样硬化引起的最常见的器官病变之一。动脉粥样硬化是机体脂质代谢异常及多因素引起的一种特殊的慢性炎症反应[1]，大量的免疫细胞参与其中。近年来，适应性免疫在动脉粥样硬化中的作用得到了广泛的关注[2]。越来越多的研究证实，CD4+T 细胞的活化在机体炎症反应介导的自身免疫应答中发挥着重要的作用，其中Treg和Th17细胞的平衡在抑制自身免疫应答、维持免疫稳态中起着至关重要的作用[3]，Treg/Th17细胞比值被证明是动脉粥样硬化斑块脆弱性的敏感指标[4]。本文对冠心病患者外周血中Treg/Th17细胞比值及相关因子进行检测，为进一步探讨冠心病的发病机制提供理论基础。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2017年1月至2018年1月于郑州大学第五附属医院经冠状动脉造影确诊为冠心病的患者61例。A组13例，为轻度冠心病患者(冠状动脉狭窄程度<30%)；B组和C组分别在(16.4±8.4)和(20.2±9.7)个月前行冠状动脉支架植入术,B组为无冠状动脉粥样硬化进展患者15例，C组为在原冠状动脉中有进行性冠状动脉粥样硬化患者(新的狭窄超过50%)15例；D组18例，为存在3支冠状动脉病变且不能行支架植入术的严重冠心病患者。纳入标准：①符合国际心脏病学会冠心病的诊断标准。②所有患者自愿参加本研究并签署知情同意书。排除标准：①近6个月发生过急性心肌梗死。②有自身免疫病及自身免疫病史的患者。③瓣膜性心脏病(风湿性心脏病等)。④合并肾病或者其他重要脏器功能不全者。⑤近期服用过免疫抑制药物、非甾体类抗炎类药、类固醇等可能影响外周血中Treg 细胞水平的药物。⑥患有恶性肿瘤或有肿瘤史的患者。

1.2标本的采集取早晨空腹静脉血2 mL于加入肝素的无菌管中，加入Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心获取人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)，用于外周血中 Treg和Th17 细胞检测；另取不加肝素的静脉血2 mL，离心后分离血清，保存在-80 ℃的冰箱中，用于细胞因子的检测。

1.3流式细胞术检测外周血Treg细胞每个样本用2支FCM试管，分别标记对照管和实验管，每个FCM管中加 2×106个PBMC，向对照管中滴加CD4-PE和IgG-FITC 抗体各10 μL，实验管中加入 CD25-PE和CD4-FITC 抗体各 10 μL，振荡摇匀后室温避光孵育 30 min，清洗，离心去上清；加入破核固定液，室温避光孵育 20 min，清洗，离心去上清；用 300 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测 Treg 细胞。

1.4流式细胞术检测外周血Th17细胞用RPMI 1640培养液重悬PBMC，加入佛波酯、离子霉素和莫能霉素，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱孵育 4 h，收集细胞，清洗，离心去上清，每个流式管内加入100 μL密度为 2×106mL-1的 PBMC，加入鼠血清封闭细胞表面FcR， 4 ℃孵育30 min；加入 10 μL CD4-Percp抗体，混匀，4 ℃避光孵育 30 min，清洗，离心去上清；加入破膜液，室温避光孵育 30 min，清洗，离心去上清后加入 IL-17A-PE 抗体，室温孵育 30 min，清洗，离心去上清；用 300 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测Th17细胞。

1.5外周血血清中IL-10、IL-17和TGF-β水平的检测采用ELISA法。取保存于-80 ℃冰箱中的血清，用双抗夹心的ELISA试剂盒检测患者外周血清中IL-10、IL-17和TGF-β水平，具体操作步骤按美国R&D 公司的ELISA试剂盒说明书进行。

1.6统计学处理采用SPSS 22.0对数据进行统计分析。4组患者外周血Treg、Th17细胞及其比值和血清TGF-β、IL-10、IL-17水平的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；4组患者一般临床资料的比较采用χ2检验或单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组患者一般临床资料的比较4组患者的年龄、性别构成、高血压发生率、总胆固醇与甘油三酯水平比较，差异均无统计学意义，见表1。

表1 4组患者一般临床资料比较

2.2各组患者外周血中Treg、Th17细胞和Treg/Th17比值的比较结果见表2。可知，4组患者外周血中Treg、Th17细胞和Treg/Th17比值比较，差异均有统计学意义。与A组相比，D组外周血中Treg细胞和Treg/Th17比值降低，Th17细胞比例升高。

表2 4组患者外周血中Treg和Th17细胞及Treg/Th17比值的比较

*：与A组相比，P<0.05

2.3各组患者血清中IL-10、IL-17和TGF-β水平的比较结果见表3。可知，4组患者血清IL-10和IL-17水平比较，差异有统计学意义；且两两比较结果显示，D组患者血清IL-10水平低于A、B、C组。

表3 4组患者血清中IL-10、IL-17和TGF-β 水平的比较 ng/L

*：与A组相比，P<0.05

3 讨论

动脉粥样硬化的发病机制曾有多种学说，包括脂质浸润学说、血栓形成学说、炎症学说，是动脉壁的一种炎症性疾病[5]。而冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变的常见类型之一，多发生在40岁以上男性，近年来发病呈年轻化趋势，是目前全世界病死率最高的疾病之一[6]。Treg细胞与Th17细胞是近年来新发现的CD4+T细胞的两种亚型，由于相互拮抗而备受关注[7]。Treg/Th17比值已经成为免疫炎性疾病领域中研究的新热点。Treg 细胞主要通过分泌 IL-10 和 TGF-β 等抗炎因子，或直接与细胞接触发挥抗炎与免疫抑制作用[8]。研究[9]表明在动脉粥样硬化、高血压、缺血性卒中等心血管疾病患者中均出现Treg细胞的减少和功能的下降。

Th17 细胞分泌IL-6、IL-8 和 IL-17 等多种促炎因子发挥促炎作用，其作用在心血管疾病如风湿性心肌病、动脉粥样硬化、心肌炎等中也得以证实[10]。该研究结果显示，与轻度冠心病患者相比，有进行性冠状动脉粥样硬化患者和严重冠心病患者的外周血中Treg细胞及Treg/Th17比值降低，而Th17细胞升高，提示有进行性冠状动脉粥样硬化患者和严重冠心病患者Treg/Th17细胞向Th17细胞分化的趋势增强。

Treg/Th17细胞的功能受细胞频率、分泌相关细胞因子和关键转录因子水平的影响。研究[11-12]证实，外周血中Treg细胞降低，Treg相关细胞因子如IL-10和TGF-β、转录因子水平显著降低，Th17细胞、Th17相关细胞因子如IL-17、IL-6、IL-23、转录因子水平增加多发生在不稳定性心绞痛患者和心肌梗死患者中。IL-10是一种重要的体内抗炎细胞因子，它既能抑制单核细胞的活性，又能抑制TNF-α、IL-6、IL-8 等炎症因子的产生，减轻炎症对血管的损伤。该研究结果亦表明，存在3支冠状动脉病变且不能行支架植入术的严重冠心病患者外周血中IL-10水平显著低于程度较轻的冠心病患者。有学者[13]通过对 IL-17 以及 IL-17 诱导的IL-6、IL-8 在不稳定心绞痛患者血清中表达的对比，发现IL-17 在冠心病患者中的高表达是导致斑块不稳定、破裂的重要因素。此外，又有研究[14]表明，使用IL-17A抗体中和处理后，小鼠动脉粥样硬化斑块的进展明显受到抑制。表明纠正IL-10/IL-17细胞因子的平衡亦可以调节冠心病患者体内炎症平衡的状态。

综上所述，冠心病患者冠状动脉病变的严重程度与Treg/Th17比值可能有关，可以将Treg/Th17比值作为冠心病辅助诊断、判断预后的关键指标。