猪流行性腹泻病毒JS2008株的传代培养及遗传变异分析

朱琳　孙冰　孙杰　郭容利

摘要：【目的】明确猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）JS2008株的序列特征及其连续传代后的序列变化规律，为筛选出新的疫苗候选毒株提供参考依据。【方法】将分离自华东地区某发病猪场的PEDV JS2008株在Vero细胞系上传代培养至100代，选取部分代次进行病毒滴度测定；每隔10代提取病毒RNA，采用RT-PCR对各代次病毒的S基因、ORF3基因和N基因进行扩增，并与PEDV经典和流行参考毒株进行序列比对及遗传变异分析。【结果】PEDV JS2008株经连续传代至100代，其病毒滴度由105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL。JS2008株在传代过程中共有11处碱基发生突变，其中9处发生在传代培养的第10～20代，变异主要位于S基因上（7/11）；同时发现JS2008株及其传代株与attenuated DR13株的相似性最高。基于S基因和N基因序列构建的PEDV系统发育进化树均表明JS2008株各代次与attenuated DR13株同处于Group 3进化群；基于ORF3基因序列构建的PEDV系统发育进化树则显示，JS2008株各代次与attenuated DR13株均处于同一进化群（Group 2）。【结论】PEDV JS2008株通过Vero细胞系进行体外连续传代至100代，其碱基突变主要发生在病毒传代培养的第10～20代，病毒滴度明显提高，抗原量增加，为研制新型PEDV疫苗提供可能，同时推测病毒传代培养10～20代是病毒发生变异以适应细胞培养的活跃期。

关键词： 猪流行性腹泻病毒（PEDV）；JS2008株；传代培养；遗传变异

中圖分类号： S858.28 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）09-1833-08

0 引言

【研究意义】猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）为单股正链RNA病毒，隶属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）（Huang et al.，2013）。PEDV能引起仔猪腹泻、脱水，致死率高，给养猪业造成巨大损失；成年猪感染后主要导致厌食、嗜睡和腹泻，但死亡率低（de Vries et al.，1997）。自1978年在比利时首次报道PEDV CV777株以来（Pensaert and de Bouck，1978），已在欧洲、亚洲及美洲的多个国家和地区暴发，且至今仍在广泛流行。目前，我国商品化的PEDV疫苗主要有传统的灭活苗和弱毒苗，但免疫效果并不理想，尤其是近年来PEDV再次暴发流行，表明传统疫苗已不能有效预防该病的发生（Lin et al.，2017）。因此，重新寻找更加有效安全的疫苗候选毒株对防控PEDV暴发流行具有重要意义。【前人研究进展】PEDV的基因70%是聚合酶基因，编码复制酶聚合蛋白（Li et al.，2013），其编码的结构蛋白包括纤突糖蛋白（Spike glycoprotein，由S基因编码）、膜蛋白（Membrane protein，由M基因编码）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，由N基因编码）、囊膜蛋白（Envelope protein，由E基因编码）及附属的ORF3基因（Li et al.，2013；高君恺等，2014；祁寒松等，2017；祁光宇等，2018）。在PEDV的自然流行感染过程中，S基因极易发生突变，尤其在病毒与细胞间的膜融合及病毒侵入过程中扮演重要角色，其中S蛋白的S1结构域负责结合细胞受体，而S2结构域负责细胞膜融合活性，即S基因变异与冠状病毒的宿主适应性和种间传播关系密切（Belouzard et al.，2012；Lin et al.，2017）；在PEDV体外连续传代对细胞系的适应过程中，S基因的变异起决定性作用（刘双喜，2017）。Park等（2008）研究表明，以细胞传代培养冠状病毒时，高代次病毒会出现ORF3基因突变，且通过细胞系适应传代PEDV，即ORF3基因的变异可能会使其毒力下降。姜艳平等（2015）研究证实，N基因是PEDV相对保守的基因，N蛋白是PEDV感染检测的最佳蛋白，但该基因的变异可能会导致其无法被目前的常规检测手段检出。此外，Lin等（2017）研究表明PEDV致弱是基因组多个突变组合的结果，且可通过多种分子机制发生。【本研究切入点】明确PEDV的基因序列特征及连续传代后的序列变化规律，可为筛选候选疫苗株奠定基础，但目前关于PEDV体外培养传代的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】将分离自华东地区某猪场（免疫后仍发病）的PEDV JS2008株在Vero细胞上连续传代至100代，对各代次病毒的S基因、ORF3基因和N基因进行扩增测序与遗传变异分析，明确该毒株的序列特征及其连续传代后的序列变化规律，为筛选出新的疫苗候选毒株提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

PEDV JS2008株（KC210146.1）由本课题组分离自华东地区某猪场发生急性肠炎与水样腹泻的仔猪排泄物（Li et al.，2013）；Vero细胞系由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患实验室保存提供，使用含5%胎牛血清的DMEM培养基，于5% CO2、37 ℃培养箱中进行培养。

1. 2 引物设计与合成

根据GenBank中PEDV CV777株和JS2008株的核酸序列，设计特异引物扩增JS2008株各代次的S1基因部分片段、S2基因部分片段、N基因全序列及ORF3基因全序列，引物序列详见表1。

1. 3 PEDV JS2008株传代及其病毒滴度测定

PEDV JS2008株以106.5 TCID50/0.1 mL接种于形成良好单层的Vero细胞上，加入2%胰酶，于5% CO2、37 ℃培养箱中孵育1 h，更换培养液继续培养，待出现明显细胞病变时回收病毒，反复冻融3次后继续传代，传代病毒均置于-80 ℃保存。选取PEDV JS2008株第20、40、60、80和100代及其亲本株进行病毒滴度测定。

1. 4 病毒RNA提取

在PEDV JS2008株传代培养过程中，收集各代次细胞培养产物，包括Vero细胞和培养基上清， -80 ℃冻存备用。取1、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100代次细胞培养产物，反复冻融3次，采用Column Vrial RNAout Kit（北京天恩泽基因科技有限公司）提取总RNA，溶于20.0 μL DEPC水中， -20 ℃保存待检。

1. 5 RT-PCR扩增及测序

基于表1中的特异引物，使用EasyScript One-Step RT-PCR SurperMix Kit（北京全氏金生物科技有限公司）RT-PCR扩增1、10、20[…]90、100代次JS2008株的S1基因、S2基因、N基因和ORF3基因。反应体系20.0 μL，包括：10.0 μL 2×One-Step Reaction Mix，0.4 μL One-Step Enzyme Mix，0.4 μL上游引物（10 μmol/L），0.4 μL下游引物（10 μmol/L），3.0 μL RNA模板，以无RNA酶水补足至20.0 μL。扩增程序：45 ℃反转录30 min；94 ℃预变性5 min及如下35个反应循环[（1）S1基因：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；（2）S2基因：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；（3）N基因：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 min；（4）ORF3基因：94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s]；最后72 ℃延伸10 min。RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，以AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國AxyGen公司）进行回收纯化。将目的cDNA连接pMD19-T载体后，送至南京思普金生物科技有限公司测序。

1. 6 序列分析

使用DNAMAN、DNASTAR和MEGA等在线软件比对分析PEDV JS2008株各代次与典型毒株的核酸序列，包括经典毒株CV777（AF353511.1）及近期流行于我国、美国、韩国的毒株[AJ1102（JX188454.1）、LC（JX489155.1）、GD-1（JX647847.1）、AH2012（KC

210145.1）、JS-HZ2012（KC210147.1）、BJ-2011-1（JN

825712.1）、CH/S（JN547228.1）、IA1（KF468753.1）、IA2（KF468754.1）、USA-Colorado-2013（KF272920.1）、USA-lowa-18984-2013、virulent DR13（JQ023161.1）和attenuated DR13（JQ023162.1）]。

2 结果与分析

2. 1 JS2008株不同代次病毒滴度测定结果

选取PEDV JS2008株第20、40、60、80、100代传代毒株及其亲本毒株进行滴度测定，结果发现在传代过程中，JS2008株的病毒滴度由105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL（图1）。

2. 2 基因序列相似性分析结果

2. 2. 1 S1基因的相似性 采用DNASTAR（Clus-talW分析）和MEGA 5.0对JS2008株各代次的基因序列与其他PEDV参考株的序列进行比对分析，结果发现JS2008株原代S1基因序列片段与attenuated DR13株的相似性最高（99.4%），但传代至第20代发生变异后，其相似性降至98.9%（图2）。

2. 2. 2 ORF3基因的相似性 采用DNASTAR（Clus-talW分析）和MEGA 5.0对JS2008株各代次的基因序列与其他PEDV参考株的序列进行比对分析，结果发现JS2008株原代ORF3基因序列与attenuated DR13株的相似性最高，为99.1%，尤其是传代至第100代后其相似性升高至99.3%（图3）。

2. 2. 3 N基因的相似性 采用DNASTAR（Clus-talW分析）和MEGA 5.0对JS2008株各代次的基因序列与其他PEDV参考株的序列进行比对分析，结果发现JS2008株原代N基因与attenuated DR13株的相似性最高，为99.8%，传代至第20代发生变异后与attenuated DR13株的相似性达99.9%（图4）。

2. 3 各代次JS2008株基因序列比对分析结果

2. 3. 1 S基因序列比对分析 以DNAMAN中的Alignment进行分析，发现在JS2008株传代过程中S基因序列的第26、68、83、99、896、938和962位点发生突变，突变位置如图5中箭头所指，且7处碱基突变均发生在第10～20代传代期间，而随后的传代中未出现变异。在这些发生突变的位点中，JS2008株原代位点与attenuated-DR13株相同，而突变后的位点与多数近期流行的变异毒株相同，如AH2012、JS-HZ2012、AJ1102和IA1等毒株。

2. 3. 2 ORF3基因序列比对分析 在选取的ORF3基因序列中，JS2008株传代过程共出现3处碱基变异，分别在第519、713和787位点（图6）。其中，第519位点的突变出现在第10～20代传代过程中，而第713和787位点的突变出现在较高代次中。JS2008株的第519和713位点，与其他所有PEDV参考株的碱基均不同，但经传代培养发生变异后，与其他PEDV参考株变得一致；第787位点的突变较特殊，发生在第70～80代传代过程中，且该碱基不同于其他PEDV参考株。

2. 3. 3 N基因序列比对分析 JS2008株在Vero细胞系上的传代过程中，N基因的第327位点发生突变，且该突变与S基因发生的突变相似，也出现在第10～20代的传代过程中，随后传代至100代时该突变仍然稳定保留（图7），N基因在传代过程中出现的突变并未引起氨基酸变化。

2. 4 各代次JS2008株遗传进化分析结果

2. 4. 1 S基因序列遗传进化分析 综合已知代表毒株序列，应用MEGA 5.0构建基于S基因序列的PEDV系统发育进化树，结果显示，JS2008株原代与其第10代传代株和attenuated DR13株处于同一分支，第20～100代传代株则聚为另一分支，但均属于Group 3进化群（图8）。

2. 4. 2 ORF3基因序列遗传进化分析 综合已知代表毒株序列，应用MEGA 5.0构建基于ORF3基因序列的PEDV系统发育进化树（图9），结果显示，JS2008株各代次与attenuated DR13株均处于同一进化群（Group 2）。

2. 4. 3 N基因序列遗传进化分析 综合已知代表毒株序列，应用MEGA 5.0构建基于N基因序列的PEDV系统发育进化树（图10），结果显示，JS2008株各代次与attenuated DR13株均处于同一进化群（Group 3）。

3 讨论

本研究将分离自华东地区某发病猪场的PEDV JS2008株进行体外连续传代至100代，并对各传代株的病毒滴度及遗传变异情况进行分析测定。在传代过程中，每隔10代进行病毒滴度检测，发现病毒滴度由亲本株的105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL，病毒滴度明显提高。Huang等（2013）研究认为，JS2008株是疫苗株attenuated DR13的变异株，其原因是二者的基因序列相似度极高。attenuated DR13株是适应Vero细胞系的毒株，而JS2008株也能在Vero细胞系中稳定传代培养，进一步证实这两株毒株间的同源关系。此外，对PEDV JS2008株各代次的多个基因序列进行比对分析，结果发现其碱基变异主要出现在S基因上（7/11），且这7处碱基突变均发生在传代至第10～20代間，随后的传代中则未出现变异；而遗传进化分析结果显示，JS2008株原代与其第10代传代株和Attenuated DR13株处于同一分支，第20～100代传代株则聚为另一分支，即传代株呈向强毒株变异的趋势；同时发现JS2008株各代次的ORF3基因与弱毒株的相似性呈升高趋势，说明ORF3基因在PEDV致弱方面发挥重要作用（Beall et al.，2016）。

与PEDV强毒株AH2012/12（Fan et al.，2017）相比，本研究经传代获得的JS2008第100代传代株毒力很弱，并未因相似性降低而导致毒力变强，但在传代过程中其病毒滴度明显提高，因此推测S基因的突变位点与PEDV能更好适应Vero细胞系相关；同时JS2008第100代传代株与亲本株的毒力比较，还需进一步通过动物试验证实。ORF3基因和N基因的序列分析结果显示，JS2008株与attenuated DR13株的相似性最高，且各基因序列分析结果均表明JS2008株与attenuated DR13株处于同一进化群（Group 3）。attenuated DR13株在ORF3基因中有一段缺失序列，是其与virulent DR13株的主要区别；而JS2008株及其传代株的ORF3基因序列并无缺失，与virulent DR13株或CH/S株的序列相同。故推测JS2008株可能是attenuated DR13株发生变异，且与CH/S株或其他类似流行毒株发生基因重组而获得的毒株（Li et al.，2013）。本研究发现，在JS2008株的传代过程中，ORF3基因发生变异后促使该毒株与attenuated DR13株的相似度提高，即适应细胞培养后，JS2008株的ORF3基因序列发生变异使其更接近attenuated DR13株。attenuated DR13株本身为适应细胞系培养的疫苗毒株，同时JS2008株在传代过程中其病毒滴度明显提高，表明ORF3基因的变异可能有助于提高PEDV对培养细胞系的适应性。此外，本研究发现JS2008株传代过程中的碱基突变（9/11）主要发生在病毒传代培养的第10～20代，推测病毒传代培养10～20代是病毒发生变异以适应细胞培养的活跃期。

4 结论

PEDV JS2008株通过Vero细胞系进行体外连续传代至100代，其碱基突变主要发生在病毒传代培养的第10～20代，病毒滴度由105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL，抗原量增加，为研制新型PEDV疫苗提供可能，同时推测病毒传代培养10～20代是病毒发生变异以适应细胞培养的活跃期。

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（責任编辑 兰宗宝）