低氧调控EIMD后骨骼肌细胞膜损伤的研究

黄巧婷　徐玉明　许杰　曹建民 李俊平 韩婷婷 覃丽凤

摘 要：目的：探讨一次间歇性离心运动后低氧暴露大鼠血清CK、LDH和腓肠肌EBD阳性纤维的变化。方法：56只健康雄性SD大鼠分为安静对照组、运动后常氧恢复24 h、48 h、72 h组和运动后低氧暴露24 h、48 h、72 h组。运动组大鼠进行一次间歇性离心运动后，于不同环境下恢复。免疫组织化学的方法和ELISA双抗夹心法检测各组大鼠腓肠肌EBD阳性纤维和血清CK、LDH的值。结果：1）急性运动后，低氧暴露24 h组大鼠血清CK非常显著低于常氧恢复24 h组，而低氧暴露72 h组大鼠血清CK则非常显著高于常氧恢复72 h组（P<0.01）；2）低氧暴露72 h组大鼠血清LDH非常显著高于常氧恢复72 h组（P<0.01）；3）低氧暴露24 h和72 h组大鼠腓肠肌阳性细胞率非常显著高于常氧恢复24 h和72 h组（P<0.01）。而低氧暴露48 h组大鼠腓肠肌阳性细胞率则非常显著低于常氧恢复48 h组（P<0.01）。结论： 离心运动后急性低氧暴露可加剧骨骼肌细胞膜的损伤。随着低氧暴露时间的延长，机体产生了短暂适应，细胞膜完整性得到一定恢复。

关键词：低氧；离心运动；EIMD

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2018）04-0081-06

Abstract：Objective： To explore the effects of hypoxia on cell membrane after acute eccentric exercise. Methods： 56 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 7 groups including sedentary group， normoxia recovery for 24 h， 48 h， 72 h groups after eccentric exercise and hypoxia exposed for 24 h， 48 h， 72 h groups after eccentric exercise with 12.7 % O2. All exercise groups went through different recovery protocols after an acute eccentric exercise. Results： 1） Serum CK in hypoxia exposed for 24 h group after eccentric exercise was lower than normoxia recovery for 24 h group， serum CK in hypoxia exposed for 72 h group was higher than normoxia recovery for 72 h group （P<0.01）； 2） Serum LDH in hypoxia exposed for 72 h group was higher than normoxia recovery for 72 h group （P<0.01）； 3） The ratio of EBD-positive cell in hypoxia exposed for 24 h， 72 h groups were significantly higher than normoxia recovery for 24 h， 72 h groups， but the 48 h group was the opposite. Conclusion： After eccentric exercise， the acute hypoxic exposure can aggravate the damage of sarcolemma； with the extension of hypoxic exposure time， the body adapted to the situation for a short time and a part of the integrity of sarcolemma was recovered.

Key words：hypoxia； eccentric exercise； EIMD

机体从事过高强度或/和长时间反复运动后产生的肌纤维微损伤叫运动性肌肉损伤（exercise-induced muscle damage，EIMD）。随着高原训练的广泛应用，由其演變而成的“常压低氧训练”逐渐受到国内外体育工作者的重视。实验室的前期研究发现，除了机械应力牵拉之外，单纯低氧刺激也可导致肌纤维膜完整性下降。另外，我们通过比较低氧运动后的低氧恢复和常氧恢复，发现低氧下恢复大鼠骨骼肌的恢复速度比常氧下恢复快。那么，机体运动后的低氧暴露对骨骼肌细胞膜究竟有何影响，这是我们需要研究的课题。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象与分组

8周龄SPF级别雄性SD健康大鼠56只，体重为196.75±8.14克，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-001。国家标准啮齿类动物饲料喂养，分笼饲养，自由饮食、进水，12 h光照/12 h熄灯模拟日昼交替。

大鼠先适应环境3天，根据体重采用随机数表法随机分为7组，每组8只，为安静对照组（C），运动后常氧恢复24 h组（24 h）、48 h组（48 h）和

72 h组（72 h）及运动后低氧暴露24 h组（D24 h）、48 h组（D48 h）和72 h组（D72 h）。具体分组见表1。

1.2 运动方案与低氧处置

除安静对照组外， 所有大鼠在常氧环境下进行为期4 天的适应性跑台训练和一次间歇性下坡跑离心运动， 运动参数为： 速度26.8 m/min， 坡度-16° ， 运动5 min×10 组，组间歇1 min。

运动后常氧恢复组大鼠置于常氧环境中饲养恢复，而低氧暴露组大鼠置于常压低氧环境中饲养，低氧的氧浓度为12.7%（DY-30 制氮机，北京创文气体设备有限公司；UP5-5.5 空气压缩机：美国英格索兰公司；RD-8HA冷冻干燥机：杭州超滤；KY-2F 控氧仪，浙江建德）。

1.3 取材与处理

大鼠在取材前24 h，每组取2只大鼠进行腹腔注射荧光染料伊文氏蓝（evans blue dye，EBD，Sigma）。注射前EBD 通过Millex -GP 0.22 μm 过滤器（Millipore，Bedford）进行灭菌，注射量为1 mg EBD/0.1 ml PBS（PBS，pH 7.4）/10g 体重。其中， 24 h和D24 h组EBD注射时间为运动后即刻，48 h和D48 h组EBD注射时间为运动后24 h，72 h和D72 h组EBD注射时间为运动后48 h。注射量为1 mg EBD/0.1 ml PBS（PBS，pH 7.4）/10 g体重。

根据不同组别，分别于运动后24 H、48 H和72 H用2%的戊巴比妥钠按（2.3 ml/kg）腹腔注射麻醉。腹主动脉取血后，迅速分离腓肠肌。于冰上切成小块，用锡纸编号、包好，迅速投入液氮中，冰冻暂存，待取材完成后把腓肠肌标本转移至-80℃冰箱保存。

将分离好后的腓肠肌于冰上切取3×3×5 mm3大小的腓肠肌，放在提前加入OCT包埋剂的胶囊壳上，均匀包埋。然后投入用液氮预冷的装有正己烷（-70℃）的小烧杯中速冻，用锡纸包裹好放入液氮保存，用于制作冰冻切片。

1.4 血清CK和LDH测试

采用ELISA双抗夹心法检测大鼠血清肌型肌酸激酶（creatine kinase， muscle， CKM）水平和乳酸脱氢酶（Serum Lactate Dehydrogenase， LDH）的含量，具体操作方法如下：

1）每孔加入10 μl样品（或标准品），根据预实验结果，如果样品浓度高，可用standard dilution稀释至终体积为100 μl。用standard dilution作为空白对照。

2）封好板子，37 ℃孵育30 min。

3）倒掉溶液，Wash Buffer洗5次，每次200 μl。

4）在吸水纸上轻弹板子，液体倒干净，待用。

抗体-抗原-抗体反应

1）每孔加入100 μL HRP-Conjugate，37℃ 30 min。

2）倒掉溶液，Wash Buffer洗5次，每次200 μl。

3）在吸水纸上轻弹板子，液体倒干净，待用。

显色反应

1）每孔加入50 μl的 Chromogen Solution A 和Chromogen Solution B，

37℃ 5～20 min。

2）看到显色反应，加入50 μlStop Solution。

3）30 min之内，在酶标仪450 nm测定OD值。

1.5 细胞膜的完整性检测

EBD染色后的组织块在Leica 冰冻切片机（CM 1850）内进行切片，厚度为6 μm。随后在激光共聚焦显微镜（DMI4000B， 394321 LEICA）下直接观察，采集相同的视野。每样本测量上、下、左、右、中部5个视野，并通过IPP光密度分析软件统计EBD阳性细胞数，以此反映肌纤维细胞膜完整性改变程度。

1.6 数据处理

所有数据均以“平均数±标准差”（[AKX-]±S）的形式表示，数据处理使用SPSS19.0统计软件包统计。所得实验数据采用双因素方差分析（Two-way ANOVA），对氧浓度及不同的取材时间因素（运动后24 h、48 h和72 h）的主效应以及两者的交互作用进行分析。并采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和非参数检验等方法（Nonparametric Tests）进行各组间的差异显著性检验。统计学显著性水平定义为P<0.05，非常显著性水平定义为P<0.01。

2 研究结果

2.1 离心运动后低氧暴露大鼠血清CK和LDH含量的变化

一次间歇性离心运动后，不同组别大鼠血清CK发生了较明显的变化，详细情况见表2、图1。

统计结果显示，不同氧浓度及运动后不同时间点两因素对大鼠血清CK、LDH含量變化以及二者的交互作用均不显著（P>0.05），因此逐一分析各组的单独效应。一次间隙性离心运动后常氧环境下恢复，大鼠血清CK活性逐渐升高，于运动后24 h达到峰值，与安静对照组相比，具有非常显著性差异（P<0.01）。随着运动时间的延长，血清CK活性逐渐下降，至离心运动后72 h，大鼠血清CK略低于安静对照组，但组间无显著性差异。随后比较离心运动后大鼠于不同氧浓度下恢复发现，常氧运动后低氧暴露24 h组大鼠血清CK水平非常显著性低于常氧运动后常氧恢复24 h组（P<0.01），而常氧运动后低氧暴露72 h组血清CK水平非常显著性高于常氧运动后常氧恢复72 h组（P<0.01）。

一次间歇性离心运动后，常氧恢复各组大鼠血清LDH含量与安静对照组相比，均无显著性差异。而通过比较离心运动后大鼠于不同氧浓度下恢复，发现仅常氧运动后低氧暴露72 h组大鼠血清LDH含量与常氧运动后常氧恢复72 h组相比，显著升高，具有非常显著性差异（P<0.01）。如表3、图2所示。

2.2 低氧对一次性间歇离心运动后骨骼肌EBD阳性细胞率的影响

统计结果显示，除不同氧浓度及运动后时间两因素对腓肠肌阳性细胞率的影响以及二者的交互作用均不显著（P>0.05），因此逐一分析各组的单独效应。结[LL]果表明，除安静对照组外，常氧恢复组和低氧暴露组均出现不同程度的EBD染料侵入，即EBD阳性纤维（图3）。

一次性间歇离心运动后常氧环境下恢复，骨骼肌阳性细胞率随着运动后时间的延长而增加，于运动后48 h达到峰值，随后逐渐下降。常氧运动后常氧恢复24 h组和常氧运动后常氧恢复48 h组大鼠腓肠肌阳性细胞率与安静对照组相比，具有非常显著性差异（P<0.01）。随后比较离心运动后大鼠于不同氧浓度下恢复，发现常氧运动后常氧恢复24 h组和常氧运动后常氧恢复72 h组大鼠腓肠肌阳性细胞率非常显著低于相同时间点低氧暴露24 h组和72 h组（P<0.01）。而常氧运动后常氧恢复48 h组大鼠腓肠肌阳性细胞率非常显著高于常氧运动后低氧暴露48 h（P<0.01）。如表4、图4所示。

3 分析讨论

3.1 离心运动后低氧暴露对大鼠血清CK和LDH的影响

肌酸激酶（CK）广泛分布于人体骨骼肌和心肌等组织细胞内，与机体能量代谢有着密切关系，如骨骼肌收缩、神经功能、细胞膜的稳定性等[1]。CK作为人体内大分子蛋白，在正常情况下不能直接进入循环系统，当骨骼肌细胞膜通透性发生改变时，CK可由损伤组织细胞渗透入细胞间隙参与血液循环[2]。乳酸脱氢酶（LDH）可催化乳酸向丙酮酸转换，在骨骼肌发生损伤时其活性显著增加。因此CK和LDH常用来评价运动性肌损伤时骨骼肌细胞膜通透性的改变。

崔玉鹏[2]等研究发现血清CK和LDH活性越高，MRI信号越强，骨骼肌机械损伤越严重。马新东[3]等通过一次性间歇离心运动模型来观察大鼠骨骼肌骨架蛋白的变化，发现运动后即刻大鼠血清CK及LDH活性出现峰值，且非常显著高于安静对照组水平，随后逐渐下降，至运动后72 h，血清CK和LDH活性显著低于安静对照组水平。这样的结果在孙良[4]等人关于运动性骨骼肌损伤后不同时刻大鼠肱三头肌超微结构及肌酸激酶的变化的研究中得到了证实。高志强[5]等研究却发现，大鼠离心运动后即刻、12 h、24 h，血清CK、LDH显著上升，并呈现依次增加趋势，48 h却表现显著下降。而人体实验中，不同运动类型，血清CK、LDH则表现不同变化趋势，如大强度离心运动，血清CK、LDH于运动后48～72 h达到峰值；耐力运动，其峰值则出现在运动后6～24 h[6]。

机体在离心运动过程中，往往有选择性地募集一小部分运动单位来完成较大负荷的拉长收缩，导致单位肌纤维承受的负荷较其他收缩形式大，损伤较严重。由于离心收缩募集的运动单位较少，机体对运动刺激的反应需要一定的时间积累，故离心收缩后血清CK的峰值的时间较向心收缩晚。本研究发现，一次间歇性离心运动常氧恢复下，大鼠血清CK活性在运动后24 h出现峰值，随后逐渐降低，提示离心运动后骨骼肌细胞膜通透性增加，导致骨骼肌细胞内CK逸出增多，血清CK活性升高。随着运动后时间的延长，机体自我修复能力加强，降低了骨骼肌细胞通透性，血清CK活性降低。而低氧暴露組鼠血清CK活性增加幅度较小，仅在低氧暴露72 h显著高于常氧恢复72 h组，而低氧暴露24 h血清CK活性显著低于常氧恢复24 h组。Wevers等首先发现，受试者在进行第二次离心收缩运动时，血清CK活性水平并无显著性变化[7]，提示二次刺激可使机体产生新的适应。离心运动后12.7%氧浓度的低氧刺激，可使机体产生一个较为短暂的适应，而后随着刺激的不断加深，适应消失，损伤加剧。综合上述研究我们不难得出，虽然一定时间的低氧暴露可加剧骨骼肌损伤（如72 h），但较短时间的低氧暴露可延缓骨骼肌损伤进程。

血清LDH活性在离心运动后无论是常氧下恢复抑或是低氧暴露，虽有一定程度的下降趋势，但与安静对照组相比，均无显著性差异。而随运动后时间的延长，低氧暴露72 h组大鼠LDH活性又非常显著高于安静对照组及其余各组。LDH作为乳酸代谢的关键酶，可随骨骼肌细胞膜通透性的增加而逸出增加。大鼠血清LDH在运动后未出现显著变化，可能的原因是在本研究检测的时间点24 h之前，大鼠血清LDH活性已经经历了一个明显的变化过程，而后逐渐恢复。但随着低氧暴露的积累，血清LDH活性又突然显著性增加提示低氧加剧骨骼肌损伤可能需要一定的时间积累（约72h）。作为评价骨骼肌损伤的指标，血清CK较LDH更为敏感。

3.2 运动后低氧暴露对大鼠腓肠肌EBD阳性细胞率的影响

骨骼肌损伤的一个主要原因是细胞膜上的骨架蛋白降解，因此不少人采用更为可靠的指标EBD来进行细胞膜通透性研究。EBD是一种经典的示踪剂，易与血清蛋白结合形成伊文氏蓝-白蛋白复合物（ESA复合物）。EBD通常可在细胞外被荧光显微镜检出，若胞内大量出现，表明肌纤维膜完整性破坏，骨骼肌出现微损伤[8]。Biondi[9]等通过对12周龄大鼠一次性离心运动后进行EBD染色，发现运动后第1天大鼠即出现骨骼肌细胞膜的微损伤（EBD阳性纤维），随后逐渐下降，至运动后第3天，EBD阳性肌纤维数降至最低，而在运动后第4天大鼠骨骼肌阳性细胞数出现二次升高，而后又缓慢下降。

本研究结果发现，大鼠进行一次间歇性离心运动后常氧下恢复24 h，腓肠肌细胞出现EBD阳性纤维，且随着恢复时间的延长，细胞膜损伤加剧，于运动后48 h达到峰值，随后逐渐恢复。离心运动易导致骨骼肌细胞出现微损伤，细胞膜完整性被破坏，骨骼肌EBD染色的阳性细胞数增加[10]，这与我们的研究结果相一致，即一次性间歇离心运动易造成骨骼肌运动性肌损伤，且较严重的损伤时间点出现在运动后48 h，而不是运动后运动即刻或运动后24 h，表现为延迟性肌肉损伤。

徐玉明[11]等将大鼠分别置于常氧环境、10%氧浓度1天、10%氧浓度2天、10%氧浓度4天和10%氧浓度7天，观察单纯低氧刺激对大鼠骨骼肌的影响。研究发现，置于10%氧浓度1天的大鼠骨骼肌即出现EBD阳性纤维，且随后几天的10%氧浓度暴露大鼠阳性细胞率均大于常氧对照组。提示，机械应力并非造成骨骼肌细胞膜通透性改变的唯一原因，单纯低氧刺激（10%氧浓度）也可导致骨骼肌细胞膜出现微损伤。而我们的研究发现，将运动后大鼠暴露于12.7%氧浓度的常压低氧环境中，与常氧恢复组相比，低氧暴露组大鼠部分肌纤维于运动后24 h就出现明显的蛋白渗入，阳性细胞率显著高于常氧恢复24 h组，说明离心运动后大鼠进行24 h 12.7%氧浓度的低氧暴露，加剧了骨骼肌细胞膜的损伤。随着低氧暴露时间的延长，细胞膜的通透性下降，但低氧暴露48 h组大鼠阳性细胞率显著低于常氧恢复48 h组。而当低氧暴露时间增加至72 h，大鼠腓肠肌阳性细胞率又显著升高，低氧暴露72 h组与常氧恢复72 h组相比，具有非常显著性差异。急性低氧暴露，可使骨骼肌内代谢酶、收缩蛋白等发生急性反应，造成骨骼肌损伤。而适当的低氧刺激，可使机体产生适应性变化。邓文骞等[13]人发现，低氧预处理的大鼠可通过提高骨骼肌抗氧化能力、降低炎症反应而预防运动性骨骼肌损伤的出现。本研究EBD阳性细胞率的结果提示，运动后24 h的低氧暴露，由于机体对低氧刺激的应激反应，导致低氧暴露24 h组大鼠腓肠肌阳性细胞率显著升高。而随着低氧暴露时间的延长，机体对该刺激产生了短暂的适应，延缓了细胞膜损伤进程；但当低氧暴露72 h，由于低氧浓度刺激的累积，大鼠腓肠肌阳性细胞率显著升高。

4 研究结论

4.1 离心运动可引起大鼠运动性肌损伤，CK、EBD作为评价骨骼肌细胞膜通透性改变的指标，可更好反映骨骼肌损伤的进程。

4.2 离心运动后急性低氧暴露，可加剧骨骼肌细胞膜的损伤。随着低氧暴露时间的延长（24 h～48 h），机体产生了短暂适应，细胞膜完整性得到一定的恢复，但在72 h后恢复速率下降。

参考文献：

[1]周多奇，龚丽，钱振宇. 肌酸激酶的生理功能与运动[J].安庆师范学院学报：自然科学版，2016，22（3）：113-117.

[2]崔玉鹏，杨则宜. 血清CK活性变化与运动导致的骨骼肌损伤[J].中国运动医学杂志，2004（3）：343-347.

[3]马新东，周越，王瑞元. 一次性离心运动对大鼠骨骼肌骨架蛋白表达和肌力的影响[J].中国运动医学杂志，2012，31（1）：31-37.

[4]孙良，赵刚.运动性骨骼肌损伤后不同时刻大鼠肱三头肌超微结构及肌酸激酶的变化[J].沈阳体育学院学报，2015，34（3）：74-78.

[5]高志强，陈广卿，王国庆，等.大鼠运动性骨骼肌损伤后血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶以及波形蛋白的变化[J].中国老年学杂志，2016，36（15）：3634-3637.

[6]周越，李扬，王瑞元，李肃反，龙国东， 杨则宜. 运动性骨骼肌損伤评价指标——血清CK、LDH、Mb的比较[J].中国运动医学杂志，2008，27（2）：206-208.

[7]Wevers R A， Olthuis H P， Van Niel J C，et al.A study on the dimeric structure of creatine kinase （EC 2.7.3.2）[J].Clin Chim Acta，1977，75（3）： 377-385.

[8]Hamer P W， Mcgeachie J M， Davies M J， et al. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage：optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability[J].J Anat，2002，200（Pt 1）：69-79.

[9]Biondi O， Villemeur M， Marchand A，et al. Dual effects of exercise in dysferlinopathy [J].Am J Pathol，2013，182（6）：2298-2309.

[10]Wang R， Urso M L， Zambraski E J，et al. Adenosine A（3） receptor stimulation induces protection of skeletal muscle from eccentric exercise-mediated injury [J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 2010， 299（1）： R259-267.

[11]徐玉明. 低氧、低氧运动对骨骼肌Dystrophin、Desmin的影响[D].北京：北京体育大学，2007.

[12]邓文骞， 王玉. 低氧预处理对骨骼肌抗氧化能力及运动性肌肉损伤的影响[J].现代预防医学，2014，41（18）.