小麦-黑麦抗条锈病1BL/ 1RS易位系8-2-1的鉴定

梁邦平，刁慧珊，李家创，袁凤平，刘 洋，白宇皓，李 毛，郝冬冬，白升升，武 军，赵继新，杨群慧，陈新宏

(西北农林科技大学农学院/陕西省植物遗传工程育种重点实验室，陕西杨凌 712100)

小麦(TriticumaestivumL.)具有悠久的种植历史，是我国乃至世界的重要粮食作物，广泛种植于全球各个国家[1]。近年来小麦病害频发，严重威胁我国粮食安全，小麦条锈病是其中的主要病害之一。它是由条形柄锈菌(Puccinia.striiformisf.sp.tritici)引起的危害小麦叶片、由空气传播的真菌病害，具有发生区域广泛、传播迅速、适应性强、小种变异快和爆发性强等特点，对小麦产量和品质造成严重影响，发病轻者减产20%～40%，严重时甚至绝收[2-3]。我国为小麦条锈病发生面积最大、区域最广、发生最为严重的国家，每年都有不同程度的流行，建国以来，我国分别在1950 年、1964 年、1990 年和 2002 年发生过四次大规模的流行，每次产量损失在100万吨以上，尤其以1950 年危害最为严重，产量损失占总产量的40%以上[4-5]。

将小麦近缘属植物的抗病基因通过远缘杂交和染色体工程植入到小麦中，创制抗病新品种是防治小麦条锈病最为安全、有效的方式。目前，育种家已从十多个小麦近缘种属中获得抗条锈病基因并将其应用到育种中，如来自圆锥小麦的Yr24/Yr26和Yr36[6]，来自节节麦的Yr28[7]，来自山羊草的Yr40[8]等。目前，因条锈菌致病性变异，90%以上的小麦生产品种丧失抗锈性[9-10]，抗病资源严重不足,寻找新的抗病资源十分紧迫。黑麦(SecalecerealeL. RR,2n=14)是小麦近缘种属之一，具有普通小麦不具有或优于普通小麦的优良性状，如穗子大，籽粒中赖氨酸和蛋白质含量高，膳食纤维(DF)含量较高，分蘖能力强，根系发达，抗旱耐盐碱，耐低温，携带抗锈病(Yr9、Lr26、Sr31)、抗白粉病(Pm7、Pm8、Pm17、Pm20)和蚜虫等多种病虫害的优良性状基因。其丰富的基因资源，被用于小麦高产、抗病、抗逆等方面遗传育种研究，并取得了重大成果[11-12]。王 鑫等[13]鉴定出新的1BL/1RS矮秆种质材料SN224；甘 敏等[14]鉴定出对条中31、条中32、水 4、水 14 及水 7 等混合菌具有抗性的小麦-黑麦衍生系；1BL/1RS易位系与小麦赤霉病抗性有关联，已被广泛的应用于小麦育种中。但由于1RS携带的黑麦碱(secalin)替代了小麦 1BS 上的低分子量谷蛋白和醇溶蛋白,导致面筋品质变差、面团发黏、食品加工品质显著变劣等[16-18]。随着人们生活水平的提高，对面制品品质的需求越来越高，优质成为小麦育种目标的重要方向[19]。

8-2-1是本课题组用优质普通小麦品系W770B(2n=6X=42,AABBDD)和引进的墨西哥黑麦(SecalecerealeL.; 2n=2x=14,RR)进行杂交，经秋水仙素处理后再经过多次与W770B回交和多次人工条锈病鉴定、农艺性状分析筛选出的新衍生系，为了对8-2-1的利用奠定基础，本研究运用形态学、细胞遗传学、GISH、SCAR分子标记、SSR分子标记、SDS-PAGE和近红外谷物分析仪多种方法对8-2-1进行鉴定，并对其农艺性状进行调查，以期为该材料在小麦抗病育种中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

8-2-1由本课题组保存，W770B、中国春(2n=6X=42,AABBDD)和铭贤169(2n=6X=42,AABBDD)均由陕西省植物遗传工程育种重点实验室提供。试验所用条锈病菌种CYR31和CYR32由西北农林科技大学植保学院提供。

采用随机区组播种供试小麦材料，行长1 m，行距25 cm，株距5 cm，每个材料种植2行，三个重复，在行的垂直方向种植一行铭贤169。2015年10月5日和2016年10月10日播种在西北农林科技大学原植物所东院。

1.2 细胞学鉴定

参考Cota-Sánchez等[20]的方法提取供试材料基因组DNA。参照Wu等[21]方法进行根尖染色体的制片，观察染色体的数目。GISH程序参照Wu等[21]方法。利用Dig-Nick-Translation Mix试剂盒(Roche,Germany)用缺口平移法按照说明书对墨西哥黑麦基因组DNA进行探针标记。在OLYMPUS BX60荧光显微镜下观察，Photometrics SenSys CCD照像、保存。

1.3 分子(SCAR，SSR)标记鉴定

黑麦特异SCAR标记参考Chai等[22]、Francis等[23]、Koeber等[24]、Iqbal等[25]方法，小麦SSR 标记参考Roder等[26]和Pestsova等[27]方法。20 μL PCR反应体系，包含10×Buffer(含Mg2+) 2 μL 、dNTP 1.6 μL(2.5 μmol·mL-1)、上下游引物各1 μL(5 μmol· mL-1)、Taq酶0.2 μL(5 U·μL-1) 、模板DNA(50 ng·μL-1) 2.5 μL、超纯水11.8 μL。PCR反应在PTC-200扩增仪上进行，反应程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性60 s，退火50 s，退火温度根据引物确定，72 ℃延伸1 min，30到35个循环；72 ℃ 10 min；12 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶对SCAR扩增产物进行电泳检测，用Bio-Rad凝胶成像系统观察、拍照保存。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对SSR扩增产物进行电泳检测，硝酸银染色，NAOH显色，数码相机拍照保存。

1.4 条锈病鉴定

铭贤169为感病对照，在拔节期用抖粉法，把等量的条锈病菌CYR31和CYR32与淀粉混合均匀接种，待铭贤169充分发病时参照Ma等[28]方法进行抗病反应型(IT)鉴定，按照0～4级标准，0级为免疫，1为高抗(HR)，2为中抗(MR)，3为中感(MS)，4为高感(HS)。

1.5 农艺性状调查

参考李立会和杨欣明[29]的方法调查8-2-1、黑麦和W770B的分蘖、株高、穗长、小穗数、穗粒数、千粒重等农艺性状并记录数据，每个重复调查10个单株。

1.6 谷蛋白组成分析和品质性状测定

高分子量谷蛋白的提取和SDS-PAGE 电泳参考Gupta 和Macritchie[30]的方法，分析高分子量谷蛋白的组成；利用瑞典 Perten 公司生产的近红外谷物分析仪DA7250，测定小麦籽粒的粗蛋白干基、面筋湿基、沉降值等指标。

1.7 数据处理

用SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 8-2-1的细胞学特征

对8-2-1根尖细胞有丝分裂染色体的鉴定结果表明，8-2-1染色体数目为42条。以黑麦基因组DNA为探针进行GISH鉴定，结果显示，8-2-1含有两个黄绿色的染色体臂，W770B不具有此黑麦染色体片段，推断黑麦染色体片段易位到8-2-1，为易位系(图1)。

2.2 黑麦基因组特异SCAR标记分析

用黑麦基因组SCAR标记和各个同源群SCAR标记对黑麦、W770B和8-2-1进行分析，结果表明，黑麦基因组SCAR标记AF1/AF4能够在黑麦和8-2-1中扩增出1 600 bp左右的特异条带，2个1RS SCAR标记ω-sec-p1/ω-sec-p2与ω-sec -p3/ω-sec-p4在黑麦和8-2-1中能够扩增出1 100 bp左右和400 bp左右的特异条带(图2)，说明8-2-1具有黑麦1RS染色体。

A:根尖细胞; B:根尖细胞原位杂交。图中黄绿色信号为黑麦染色体臂，其他为小麦染色体。A:Root tip cell,2n=42; B:GISH result of root tip cell.Bright yellow green signals indicate rye chromosomes.

2.3 小麦SSR标记分析

利用小麦各个基因组SSR分子标记，最终筛选出1BS上的Xwmc230，Xgwm413和Xgwm550三对引物。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(图3)显示，Xwmc230，Xgwm413和Xgwm550为引物不能在黑麦和8-2-1中扩增出相应的条带，目的条带缺失，因此，可以确定8-2-1缺失了小麦1BS染色体。说明8-2-1为小麦-黑麦1BL/1RS易位系。

M:DL2000; 1:黑麦; 2:W770B; 3:8-2-1；A:AF1/AF4; B:ω-sec-p3/p4; C:ω-sec-p1/p2。M:DL2000; 1:Rye; 2:W770B; 3:8-2-1; A:AF1/AF4; B:ω-sec-p1/p2; C:ω-sec-p3/p4.

2.4 8-2-1的条锈病鉴定及农艺性状分析

待对照品种铭贤169完全发病时调查供试材料的发病情况，结果(图4)表明，铭贤169和W770B表现为4级高感(HS)，黑麦表现为0级免疫，8-2-1表现为1级高抗(HR)，推断8-2-1可能携带墨西哥黑麦抗条锈病基因。

田间调查黑麦、W770B和8-2-1的农艺性状发现，8-2-1籽粒饱满且籽粒较大，穗子长、成纺锤形，芒较长(图5)。由表1可知，8-2-1的株高、穗长和小穗数均介于黑麦和W770B之间，3个材料间差异显著；8-2-1分蘖较少，且与黑麦差异显著，穗粒数较高，显著高于W770B；千粒重显著高于双亲。总体来看，8-2-1的农艺性状介于黑麦和W770B之间，相对于黑麦降低了株高，和W770B相比，穗长、穗粒数和千粒重显著提高，综合农艺性状好。

2.5 8-2-1的谷蛋白组成和品质分析

以中国春为对照测定供试材料的HMW-GS发现，8-2-1亚基组成为Null、7+8、2+12，W770B亚基为Null、7+16、 2+12(图6)。

M:DL2000; 1:黑麦; 2:W770B; 3:8-2-1; A:Xwmc230; B:Xgwm413; C:Xgwm5500.箭头所示为小麦1BS标记条带。M:DL2000; 1:Rye; 2:W770B; 3:8-2-1; A:Xwmc230; B:Xgwm413; C:Xgwm5500.Arrows indicate the specific amplification products of 1BS.

1:黑麦; 2:W770B; 3:8-2-1; 4:铭贤169。1:Rye; 2:W770B; 3:8-2-1; 4:Mingxian 169.

A:成株期植株; B:麦穗; C:籽粒; 1:8-2-1; 2:W770B; 3:黑麦。A:Adult plants; B:Spikes; C:Seeds; 1:8-2-1; 2:W770B; 3:Rye.

表1 8-2-1及其亲本主要农艺性状Table 1 Main agronomic traits of 8-2-1 and its parents

1:黑麦; 2:W770B; 3:中国春(CS); 4:7-1; 5:8-2-1。1:Rye; 2:W770B; 3:CS; 4:7-1; 5:8-2-1.

由表2可知，8-2-1的粗蛋白含量(干基)、湿面筋含量和Zeleny沉降值与墨西哥黑麦差异显著，与W770B差异不显著。

表2 8-2-1品质指标分析结果Table 2 Analytic result of quality parameters of 8-2-1

3 讨 论

随着近年来小麦病害的频发，小麦育种不再单一的追求高产，培育高产、稳产、抗病、抗逆和优质的新品种成为小麦育种的新目标[19]。随着农业生产模式从小农生产逐步向规模化方向发展，免耕和少耕的耕作方式、秸秆还田的普遍应用、大型收获机械跨区作业等加快了病虫害的传播，小麦病害问题日益严重，条锈病菌生理小种的快速变化，使小麦条锈病发生面积和区域不断增加，急需要培育抗病小麦新品种，以适应新的生产环境模式。20世纪八九十年代，我国大面积推广含有洛夫林血缘的系列品种，对我国小麦抗病和增产起到了积极的影响，但也导致抗源的单一和不足。当前生产上种植的普通小麦品种对条锈病的抗性较弱，缺乏有效的抗病种质资源，且条锈病生理小种容易变异，产生新的毒性，一般的抗病品种只能维持五年左右[2，31]，发掘新的抗病种质、培育广谱抗性的新品种成为当务之急。

黑麦作为小麦的近缘属植物，具有抗病、抗逆等优良性状，常被用来改良小麦遗传背景。黑麦中的抗条锈病基因Yr9 主要是通过1BL/1RS易位系导入到小麦种的，目前，黑麦中的Yr9 基因被广泛应用到抗条锈病育种当中，但由于育种亲本的选择有限和生理小种的不断变异，使得以Yr9 抗性基因为主的我国大部分麦区的主栽品种抗病性丧失[32-33]，从而增加了条锈病发生和流行的可能性。本试验通过原位杂交和分子标记等多种检测方法，能够确定8-2-1是1BL/1RS易位系，8-2-1对CYR32表现为抗病，而单独的“洛类”血缘种质对CYR32表现为感病[34]，Yr9 基因需要与其他基因共同作用才能抗CYR32[35-36]。因此，推测墨西哥黑麦中可能携带不同与Yr9 的新基因抗源并导入到8-2-1中，也可能是Yr9 基因与其他基因的互作，其抗病机理还需要更进一步的研究。

粗蛋白含量、湿面筋含量、Zeleny沉降值是衡量小麦品质的重要指标。本研究中，8-2-1粗蛋白干基含量为12.92%，湿面筋含量26.94%，均达到中筋小麦标准；Zeleny沉降值为23.22 mL，达到弱筋小麦的要求(GB/T 17320-2013)。Zhang等[37]认为，优质亚基(17+18，5+10)与面筋品质正相关，2+12亚基与面筋品质负相关，8-2-1的亚基组成为Null、7+8、2+12，可能是其品质下降的主要原因。W770B(Null,7+8,2+12)与8-2-1(Null,7+16,2+12)在Glu-B1位点编码的HMW-GS 存在差异，可能是黑麦1RS染色体导入或天然异交导致的。黑麦1RS携带或小麦自身的、处于沉默状态的转座子和逆转录转座子被激活，从而改变了编码HMW-GS的基因家族中的DNA高度重复序列的拷贝数，导致转录产物HMW-GS发生变化，HMW-GS 的变异能够占到面团品质相关变异的 35%～70%[38-39]。8-2-1与W770B在粗蛋白含量、湿面筋含量、沉降值非常接近，说明遗传背景在小麦育种中的重要性。8-2-1还具有良好的农艺性状，如早熟，粒大，穗大，千粒重优势明显，株高较矮，抗倒伏性好，可能与黑麦基因的导入有关。与附加系和代换系相比，易位系携带的不利基因更少，且遗传稳定，是比较理想的育种材料，因此可以作为培育抗病、高产和弱筋小麦新品种的中间材料。