黑麦1RS染色体臂Sec-1位点的研究进展

李亚青，张 楠，张士昌，何明琦，李孟军

（石家庄市农林科学研究院，河北省小麦工程技术研究中心，河北 石家庄 050041）

栽培黑麦（Secale cerealeL.）分蘖力强，小穗数多，抗多种病虫害，根系发达，具有抗旱、耐盐碱、耐贫瘠、耐寒、抗干热风等特性，是小麦育种中改善重要性状和丰富遗传多样性的优良基因供体[1，2]。小麦-黑麦1BL/1RS易位系是黑麦染色体存在于普通小麦染色体组的最常见的形式[3]。1BL/1RS易位系具有黑麦1RS携带的抗叶锈、秆锈、条锈和白粉病等抗病基因[4，5]，同时具有很好的丰产性和适应性[1，6，7]。在世界小麦育种中，1BL/1RS易位系作为优异基因资源被广泛利用[8，9]，是外源基因用于小麦品种改良最成功的范例[10]，也是世界小麦育种史上继矮秆基因之后的第2个革命性的工作。黑麦1RS染色体臂在提高小麦抗逆性、丰产性和稳产性的同时，也给小麦的烘烤加工品质带来了显著的负面效应。1RSSec-1位点的引入和Glu-3/Gli-1位点的缺失是造成1BL/1RS易位系小麦加工品质低下的主要原因[9，11，12]。对黑麦1RS染色体臂Sec-1位点在染色体上的定位，Sec-1位点编码的40K γ-黑麦碱和ω-黑麦碱基因家族的特征，ω-黑麦碱对小麦品质的影响，以及消除ω-黑麦碱不良影响的技术途径进行了阐述，旨为1BL/RS易位系的改良利用提供参考。

1 Sec-1位点在染色体上的定位

黑麦碱（secalin）是黑麦种子中的醇溶性储藏蛋白，根据在SDS-PAGE上的电泳迁移率分为高分子量（HMW） 黑麦碱 （high molecular weight，≥100 kDa）、75K γ-黑麦碱 （75K γ-secalin）、ω-黑麦碱（ω-secalin，48～55 kDa） 和 40K γ-黑麦碱[13]。编码HMW黑麦碱的基因位点（Sec-3） 位于1R染色体长臂上（1RL），而编码ω-黑麦碱和40K γ-黑麦碱的基因位点（Sec-1） 位于1R染色体短臂上 （1RS），编码75K γ-黑麦碱的基因位点（Sec-2）位于2R染色体上[14]。

编码黑麦碱的基因位点在染色体上的定位是黑麦碱研究工作的热点之一。在不同研究工作中，由于研究群体和方法的不同，这些编码黑麦碱的基因位点的遗传距离或重组率有所不同。Shewry等[14]通过分析2个黑麦自交系（Secale dighoricum和S.turkestanieum）组合的子代种子中的黑麦碱，发现Sec-3和Sec-1b（编码ω-黑麦碱） 的重组率为40.8%±3.76%，遗传距离为 （57.4±11.30） cM。Lawrence 等[15]分析了 2个组合（Rye26/Rye2a和Rye2a/R14） 子代种子中的黑麦碱，发现Sec-3和Sec-1的遗传距离为（45.44±9.6） cM。Sybenga等[16]通过分析5个染色体重排的黑麦和黑麦自交株系的129个子代黑麦碱，发现Sec-1位于1RS的随体上，距离端部C-带的近端至少2.5 cM，距离核仁组织区大约30 cM。Benito等[17]分析了黑麦回交子代的染色体组成、储藏蛋白和同工酶谱，发现Sec-3和 Sec-1b的遗传距离为 （24.03±2.54） cM；Sec-1a（编码40K γ-黑麦碱） 和Sec-1b紧密连锁，遗传距离为（0.33±0.33） cM。Carrillo等[18]分析了3个黑麦测交群体的黑麦碱，发现Sec-1b和Sec-1a紧密连锁，重组率为0.25%±0.25%；对1个测交群体子代的黑麦碱分析发现，Sec-1和Sec-3重组率为36.03%±4.12%。Carrillo等[19]在2个黑麦测交群体中发现了新的ω-黑麦碱，编码新ω-黑麦碱的位点与小麦的Gli-A3和Gli-B3位点同源，定名为Gli-R3（Sec-4）；Glu-R1（Sec-3） 和 Gli-R3的重组率为 33.80%±3.22%，Gli-R3和 Gli-R1（Sec-1） 的重组率为12.04%±2.21%。Orellana等[20]分析了2个黑麦自交系（8t和6Ri）的子代种子中的黑麦碱，发现Sec-3和Sec-1的重组率为44.12%±3.48%；Sec-1与着丝粒的重组率为36.27%±3.37%；Sec-1与端粒紧密连锁，重组率为9.8%±2.08%。以基因组DNA pSec2B为探针的荧光原位杂交结果表明，黑麦的Sec-1定位在1R染色体短臂的随体上，Sec-1位于随体中部的常染色质区的近端和异染色质区的远端结合部位；以rDNA和pSec2B为探针的荧光原位杂交结果显示，核仁组织区（nucleolar organizing region，NOR） 跨越1RS的次缢痕，在NOR和Sec-1之间有一个可见的间隙[21]。虽然关于Sec-1位点在染色体上定位有一定差异，但这些研究结果均表明，Sec-1位点远离着丝粒，位于1RS远端；Sec-1a和Sec-1b紧密连锁。

2 40K γ-黑麦碱和 75K γ-黑麦碱

40K γ-黑麦碱由 1RS 上 Sec-1b 编码，而 75K γ-黑麦碱由 1RL上 Sec-3编码。40K γ-黑麦碱与75K γ-黑麦碱具有同源的N端氨基酸序列，二者的区别主要体现在分子量、氨基酸组成和聚集特性3个方面。在小麦和大麦基因组中未发现75K γ-黑麦碱的同源序列，因此，75K γ-黑麦碱基因被认为是一种衍生基因。与40K γ-黑麦碱相比，75K γ-黑麦碱具有高比例的谷氨酰胺/谷氨酸酯和脯氨酸含量。这暗示，75K γ-黑麦碱基因可能来源于插入了富含谷氨酰胺和脯氨酸的 40K γ-黑麦碱基因[14]。Qi等[22]首次克隆了40K γ-黑麦碱基因全长序列，并对结构特征进行了分析。在聚类分析图上，40K γ-黑麦碱与75K γ-黑麦碱明显分为2组，这表明二者的初级结构显著不同。40K γ-黑麦碱与75K γ-黑麦碱的差别为：（1） 富含谷氨酰胺区域poly-Q的不同；（2） 重复单元的修饰；（3）N-端结构域缺失1个半胱氨酸。

3 ω-黑麦碱基因家族

Hull等[23]利用Southern blotting分析小麦/黑麦附加系估计其基因组中ω-黑麦碱基因拷贝为40～60个。Clarke等[24]利用Southern blotting分析DRA-1（来源于小麦cv.Gabo，携带来自黑麦cv.Imperial的小片段），估计DRA-1基因组中ω-黑麦碱基因拷贝为10～20个，其中大约15个基因家族成员之间为8 kb的间隔序列，这些成员间隔序列在Sec-1位点上以头尾相连方式排列，DNA序列全长约140 kb。Yamamoto等[25]利用 Fiber-FISH技术证明，在 Sec-1位点的145 kb区段上，ω-黑麦碱基因有15个拷贝，间隔序列8 kb，这些拷贝间隔序列以头尾相连方式排列，与前人研究结果[26，27]一致。PCR产物克隆测序结果表明，ω-黑麦碱基因家族包括假基因和具有转录活性的成员。截至目前，已有多个ω-黑麦碱基因从黑麦或1BL/1RS易位系小麦中克隆出来，包括来自黑麦cv.Gazelle的 3个 （GenBank No.X60294、X60295和AF000227）[24，28]、DRA-1 的 9 个[29]、1BL/1RS 易位系cv.Lankao 906的5个[26]、黑麦cv.Rogo的16个[27]、六倍体小麦cv.AC Ultima的16个[27]、Octoploid triticale line H93-5305的15个[27]、1BL/1RS易位系 cv.Bob－white的15个[27]。Li等[30]首次通过对1BL/1RS易位系cv.Shimai 15 BAC克隆测序对Sec-1 ω-黑麦碱基因家族序列进行了解析，在4个BAC克隆上发现了18个ω-黑麦碱基因家族成员，其中8个具有转录活性；基因家族成员之间的间隔序列长8.2～21.6 kb，这些成员间隔序列在BAC克隆上以头尾相连方式排列。18个ω-黑麦碱基因家族成员可分为6种类型，间隔序列可分为2类。通过分析4个BAC克隆测序数据，并结合1BL/1RS易位系cv.aikang 58基因组测序数据，构建了4个BAC克隆的跨叠群，跨叠群覆盖Sec-1 258 kb。已有研究结果表明：（1）ω-黑麦碱基因家族至少具有18个成员；（2） 这些家族成员来自共同的祖先基因；（3） 家族成员之间的间隔序列长度不等；（4）家族成员/间隔序列以头尾相连方式排列；（5）这些家族成员中仅少数成员具有转录活性；（6）ω-黑麦碱基因为无内含子基因。

4 ω-黑麦碱对小麦品质的影响

黑麦1RS染色体臂取替小麦1BS染色体臂提高了小麦的抗逆性、丰产性和稳产性，但同时也降低了其烘烤加工品质，主要表现为面团粘性增加、面筋强度减弱、面团形成时间显著变短、最大拉伸阻力降低、面团延伸性增加和面包体积减少等[9，10]。1BL/1RS易位系中，1BS上编码低分子量麦谷蛋白亚基的位点Glu-3以及编码γ-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白的位点Gli-1丧失，同时导入了1RS上编码40K γ-黑麦碱和ω-黑麦碱的Sec-1位点。Sec-1位点编码的40K γ-黑麦碱和ω-黑麦碱不能补偿Glu-3和Gli-1编码的低分子量麦谷蛋白以及γ-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白的品质效应，引起小麦麦谷蛋白聚合物结构的改变和数量的减少，导致1BL/1RS易位系对SDS沉降值、和面时间、面团延伸性、耐揉性和抗延阻力等加工品质性状产生显著的负面影响[9，11，12]。Sec-1位点编码的 40K γ-黑麦碱和ω-黑麦碱均为单体蛋白，其中ω-黑麦碱高度亲水，几乎不含半胱氨酸，无分子间和分子内的二硫键的形成[24]。黑麦碱大量吸水后又很快溶解，使面团的吸水性增大、持水性降低，致使面团的稳定性和延伸性降低，导致1BL/1RS小麦烘烤和蒸煮品质下降[31]。因此，消除ω-黑麦碱对小麦品质的不良影响是解决1BL/1RS易位系小麦面团加工品质差的重要途径之一。

5 消除ω-黑麦碱对小麦品质不良影响的途径

5.1 引入Glu-3和Gli-1位点

重组染色体遗传作图表明，黑麦Sec-1与小麦的Gli-1/Glu-3不是同源等位基因位点[32]。因此，可以通过染色体工程技术对1RS染色体进行遗传改良。在1RS染色体臂上引入Gli-1/Glu-3，提高1BL/1RS易位系品质的同时，保留其抗逆性、丰产性和稳产性。Lukaszewski[33，34]利用携带具有诱导部分同源配对基因ph1b的Pavon小麦株系对1BL/1RS易位系进行遗传改良，获得2种多点易位的改良的1RS（MA和Te），携带Gli-1/Glu-3，但缺失Sec-1位点。携带改良1RS的小麦，其配子活性降低，但在育种中的利用不受影响。

5.2 基因工程技术

任燕等[35]认为反义RNA可降低黑麦碱表达量，但由于Sec-1位点很复杂，利用反义RNA去除由Sec-1位点产生的所有RNA来降低黑麦碱含量的方法可能难以实施。柴建芳等[36]构建了ω-黑麦碱基因RNA干扰表达载体（RNAi载体），通过农杆菌介导转化小麦品种金禾9123，成功获得了纯合的转基因代株系。在转基因株系中，ω-黑麦碱表达量平均下降53%，面筋指数、沉降值和稳定时间显著提高，而其株高、穗粒数和千粒重等农艺性状无明显变化。该研究工作表明，通过遗传工程降低或去除ω-黑麦碱基因表达量，从而提高1BL/1RS易位系小麦品质的技术途径具有可行性。

5.3 重离子束诱变技术

目前，通过会议交流和私人通讯获知，国内通过重离子束诱变获得的ω-黑麦碱表达沉默突变体有2个——衡观35和石麦15。其中，1BL/1RS易位系衡观35的ω-黑麦碱表达沉默突变体由中国科学院遗传与发育生物学研究所创制；石麦15的ω-黑麦碱表达沉默突变体由石家庄市农林科学院小麦工程研究中心创制，其面团形成时间和稳定时间显著提高，而农艺性状无明显改变。目前，利用2个突变体开展的工作包括非1BL/RS易位系回交转育和1BL/RS易位系中1RS染色体臂的替换。