医用臭氧对肺纤维化大鼠的影响

李珂，张筠，张铁栓

郑州大学第二附属医院，河南郑州 450000

特发性肺纤维化 （idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种由多种原因引起的以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱为基础的肺间质疾病[1]，临床症状表现为刺激性干咳并进行性加重的呼吸困难，疾病晚期可导致低氧血症和心、肺等多种脏器功能衰竭[2]，死亡率高。目前发病机制尚未清楚，且临床上缺乏有效的治疗手段，目前多以皮质类固醇激素联合免疫抑制剂为主，但是治疗效果差，不能有效制止病情的进展和改善患者预后，而且存在一定的不良反应[3]。因此发现有效的治疗或延缓疾病进展的方法是临床研究的热点与难点。该研究于2016年8月—2017年1月，选取由郑州大学动物实验中心提供的40只清洁级雄性SD大鼠为研究对象，采用医用臭氧腹腔注射博来霉素致纤维化大鼠并观察大鼠肺泡炎及肺纤维化程度、血清和 BALF中TNF-ɑ、TGF-β1水平变化及大鼠肺功能的变化，分析其在治疗肺纤维化中的可行性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取由郑州大学动物实验中心提供的40只清洁级雄性SD大鼠为研究对象，7～10周龄，体质量（200±20）g，试剂：博来霉素注射液（浙江海正药业股份有限公司）。仪器：医用臭氧发生器（山东淄博悦华医疗器械有限公司），以及小动物肺功能测定系统 HX200型呼吸流量换能器 （北京新行兴业科贸有限公司）。ELISA试剂盒购于上海将来实业股份有限公司。

1.2 方法

40只清洁级SD大鼠被随机分为对照组、模型组、激素组及试验组，每组10只，实验条件下饲养7 d，其中模型组、激素组、试验组中的大鼠按照5 mg/kg（体质量）的剂量于气管内滴入博来霉素（BLM A5）（国药准字H20055883）制作肺纤维化模型，对照组以相同方法于气管内滴入同等体积的生理盐水（国药准字H20056626），注入后及时将大鼠旋转直立使药液在肺内分布均匀。

1.3 药物干预

气管内滴入药物24 h后，每日给予药物干预1次，试验组给予腹腔内注射医用臭氧，医用臭氧浓度为60 μg/mL，激素组给予 1.4 mg/kg地塞米松（国药准字H12020516）灌胃，对照组与模型组给予相同体积的生理盐水（国药准字H20056626）灌胃，持续28 d后处死并收集标本。

1.4 肺功能测定

全部大鼠在注入博来霉素第28天时腹腔注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠，固定在鼠板上，沿气管前正中逐层分离皮肤，暴露气管，在气管软骨环间水平剪切气管，插入Y型管，连接HX200型呼吸流量换能器，采用AniRes2005动物肺功能分析系统测定大鼠第0.2秒用力呼气容积(FEV0.3)、第0.2秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV0.2/FVC)及呼气峰流速(PEF)。

1.5 标本的留取

测定肺功能后全部大鼠右心室采血用于TNF-ɑ、TGF-β1的检测，结扎右侧肺门，分离出双肺和气管。右肺用生理盐水漂洗干净，置于10%中性福尔马林溶液中固定24 h，取材、切片、HE染色，大鼠放血完毕后左肺行肺泡灌洗，分离出气管在下段做一T形切口，采用外径约1.5 mm的气管插管插入气管，若在过程中遇到阻力，说明到达气管隆突部位，此时向左旋转插管并稍微用力即可进入左主支气管，如果重新遇到阻力说明已到达左主支气管分叉处，插管结束。无菌注射器抽取约4℃的生理盐水2.5 mL通过插管缓慢地注入到肺内，并停留约30 s，并缓慢回抽再反复注入肺内，约3次，最后将回抽液体抽取到15 mL塑料离心管中，此为第1次灌洗液，此后重复操作4次，将灌洗液收集到同一个塑料离心管中待测。

1.6 标本的观察与检测

1.6.1 病理学观察 肺组织切片、HE染色，在光学显微镜下观察肺组织形态结构的变化，根据文献[4]的报道对肺组织的肺泡炎及纤维化程度进行分级，转为计量资料。其中0级：无肺泡炎及肺纤维化；1级：轻度肺泡炎或肺纤维化，受累面积少于全肺组织的20%；3级：中度肺泡炎或肺纤维化，受累面积为全肺的20%～50%；4级：重度肺泡炎或肺纤维化，受累面积大于全肺的 50%，依次记为 0、1、2、3 分。

1.6.2 酶联免疫吸附法 （ELISA法）测定大鼠血清、BALF中TNF-ɑ、TGF-β1水平 取少量灌洗液在显微镜下计数，其余BALF无菌过滤至无菌离心管中离心，4℃，1 000 r/min,取上清液 5 mL，利用 ELISA 法测定血清和 BALF中 TNF-ɑ、TGF-β1水平。

1.7 统计方法

所有数据均应用SPSS 21.0统计学软件进行处理，计量资料应用均值±标准差（±s）表示，用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺功能的比较

与对照组相比，模型组、激素组与试验组肺功能下降明显，差异有统计学意义（P<0.05），其中模型组、激素组肺功能下降较试验组明显，差异有统计学意义（P<0.05）。 见表 1。

表1 各组大鼠肺功能的比较（±s）

表1 各组大鼠肺功能的比较（±s）

组别 F E V 0.3(m L) F E V 0.3/F V C(%) P E F(m L/L)对照组（n=1 0）模型组（n=1 0）激素组（n=1 0）试验组（n=1 0）5.9 0±0.5 2 3.3 6±0.3 3 4.2 6±0.3 5 5.0 3±0.4 8 7 8.1 5±2.1 1 4 2.9 8±1.9 1 5 0.3 8±2.0 4 6 0.9 3±1.8 1 3 8.8 2±1.4 4 2 1.9 0±1.5 6 2 6.9 5±1.2 1 3 4.3 2±1.6 3

2.2 各组病理学评分的比较

在第28天时对大鼠肺组织切片肺泡炎及肺纤维化程度进行分级评分并统计分析，结果显示，与对照组相比，模型组、激素组与试验组病理评分均大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，激素组与试验组病理评分明显小于模型组，且试验组评分下降明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组肺泡炎和肺纤维化程度比较[（±s），分]

表2 各组肺泡炎和肺纤维化程度比较[（±s），分]

组别病理评分对照组（n=1 0）模型组（n=1 0）激素组（n=1 0）试验组（n=1 0）0.0 0±0.0 0 2.8 0±0.4 2 2.1 0±0.7 4 1.4 0±0.5 2

2.3 各组血清、BALF中 TNF-ɑ、TGF-β1的比较

与对照组比较，模型组、激素组、试验组大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-ɑ、TGF-β1明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，激素组、试验组大鼠血清及肺泡灌洗液TNF-ɑ、TGF-β1明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）,其中试验组下降更明显。见表3。

表3 各组血清、BALF 中 TNF-ɑ、TGF-β1的比较[（±s），pg/mL]

表3 各组血清、BALF 中 TNF-ɑ、TGF-β1的比较[（±s），pg/mL]

组别对照组（n=1 0）模型组（n=1 0）激素组（n=1 0）试验组（n=1 0）血清T N F-ɑ T G F-β 1 B A L F T N F-ɑ T G F-β 1 1 0.0 7±0.6 4 2 8.5 8±1.4 8 1 8.1 4±1.6 7 1 2.0 3±1.4 4 6 2.9 1±1.1 6 9 6.1 1±1.5 6 8 5.0 6±1.9 7 7 5.4 1±1.9 3 1.5 0±0.0 3 2.8 9±0.1 3 1.9 5±0.7 2 1.7 5±0.5 3 1 1.9 7±0.9 4 2 3.1 3±1.4 5 1 7.9 8±0.7 9 1 5.1 0±0.7 4

3 讨论

特发性肺纤维化（IPF）是一种原因不明、慢性进行性的肺间质性疾病，病理基础主要以弥漫性肺泡炎、肺泡结构紊乱、肺间质纤维化为主[1]。一旦形成肺纤维化推荐的治疗方法是肺移植，但是成本高、不良反应多、条件有限。大多数肺纤维化患者病情进展快，预后较差，生存期短，以前大多采用激素及免疫抑制剂治疗，但疗效欠佳，不良反应大。因此发现有效的治疗或者延缓病情进展的方法迫在眉睫。

在肺纤维化的病程中，因为肺损伤产生的炎症区域会出现中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞等的浸润，这些炎性反应进而产生IL-1、TNF-α等细胞因子，炎性介质和细胞因子组成了一个复杂的网络系统，调控肺泡上皮细胞和成纤维细胞增值和凋亡，促进肺纤维化的发生[5]。TNF-ɑ是一种具有多种生物活性的细胞因子，主要是由单核-巨噬细胞分泌，在肺损伤时可以高度表达，一方面可以促进白细胞趋化聚集，发挥促炎作用，促进成纤维细胞增值，另一方面激活中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等的功能，刺激产生超氧化物，释放溶酶体酶，对其周围细胞产生毒性作用[6-7]。TNF-ɑ可以诱导人成纤维细胞胶原mRNA的表达，并促进血小板的聚集，进一步释放促纤维化细胞因子，比如 TGF-β1、血小板衍生生长因子（PDGF）等[8]。 TGF-β1是分子量为 25 kD 的多肽，由 2条分子量为11 kD的亚单位通过二硫键连接而成，主要由肺泡巨噬细胞和上皮细胞分泌。TGF-β1在多种细胞因子构成的网络系统中起着主导作用，它可以促进TNF-ɑ、IL-6、PDGF等的高表达，从而导致肺成纤维细胞的增值和纤维增生[8]。TGF-β1可促进纤维细胞激活向肌成纤维细胞转化，可导致多种器官比如肝、肾纤维化和动脉粥样硬化[9]。因此测定血清及肺泡灌洗液中TNF-α、TGF-β1的水平，再结合肺组织病理切片和肺功能结果，可以在一定程度上反应肺纤维化程度。

临床上医用臭氧可以用于腰椎间盘突出症、创伤及难治性溃疡、病毒性肝炎、癌症等的治疗。有报道称，肺纤维化与机体内氧自由基的代谢紊乱有关，如果体内缺乏清除氧自由基的过氧化物酶，则会加速肺纤维化的进程[10]。医用臭氧可以促进体内多种抗氧化酶的产生，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等，清除氧自由基，降低氧自由基对细胞的损伤[11]。文献[12]中同样应用医用臭氧提高了大鼠肺组织中超氧化物歧化酶的含量，并降低了羟脯氨酸的含量，提示医用臭氧能改善机体对氧自由基的清除能力。另外通过测定肺纤维化评分(1.2±0.4)分与肺功能证明医用臭氧可以改善大鼠肺功能，降低肺纤维化程度，在纤维化评分与肺功能的对比上与该次研究结果相符。医用臭氧同时被证明具有抗炎作用，它不仅能刺激拮抗炎症反应的细胞因子和免疫抑制因子释放，而且刺激细胞内皮释放NO和PDGF等引起血管扩张，促进炎症吸收，同时还具有一定的抗感染能力[12]。而肺纤维化患者往往多同时合并有细菌或者真菌感染。该研究结果显示，试验组大鼠通过腹腔注射臭氧，TNF-α、TGFβ1水平下降明显，结合肺功能及肺组织病理结果，进一步证明了医用臭氧能减轻肺纤维化中程度。相关机制可能是医用臭氧具有的高度的氧化性刺激了体内抗过氧化酶的过度表达，促进氧自由基的清除，拮抗炎症介质的细胞因子产生增多。缓解了肺纤维化的进一步加剧[13]。

综上所述，医用臭氧能有效抑制肺纤维化大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、TGF-β1的释放，缓解肺纤维化病程，可能这是医用臭氧治疗肺纤维化的机制之一，且具有经济、安全等优势，对于肺纤维化的治疗具有一定前景。