冬虫夏草联合丹参器官保存液对大鼠肝脏保存效果的研究

赵鹏伟 ，黄建钊 ，李玮 ，刘隽 ，张佳伟 ，柳严 ，刘江伟

1.贵州省人民医院肝胆外科，贵州贵阳 550002；2.贵州省贵阳市贵阳中医学院，贵州贵阳 550002

临床上以肝脏移植最为常见，且肝脏移植的成功率呈逐年增加的趋势，延长了肝病患者的寿命[1]。对于肝脏移植最为关键的一步就是如何更好的保存、获取高质量的移植器官，一般来说，如果常温下对肝器官不实施任何针对性保护，短期内会导致其功能降低或坏死，为了解决这一难题，器官保存液越来越多的被应用到器官移植中，使离体器官在离体环境中也能保持较好的完整性和活性，提高了器官移植的成功率，促进了器官移植的发展，但不同的器官保存液的保存效果和应用价值也是不同的，如何选取保存液使器官的保存效果达到最优，仍需要不断的研究[2]。该文以2016年3月—2017年3月该院进行肝脏移植试验的86只SD大鼠为实验对象，分析研究冬虫夏草联合丹参器官保存液对大鼠肝脏保存效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院进行肝脏移植试验的86只SD大鼠作为该次研究对象，随机数字表达法分为43例研究组和43例对照组。其中，对照组中雄性大鼠26只，雌性大鼠 17 只，体重为 240～289 g，平均体重为（264.2±0.3）g；研究组中雄性大鼠23只，雌性大鼠20只，体重为 245～300 g，平均体重为（272.3±0.2）g。 两组大鼠均已达到健康和清洁标准，且在体重、周龄等方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 对照组制作方法 对照组中采用UW保存液对大鼠肝脏进行保存。并构建SD大鼠非循环离体灌注模型[3]。具体制作如下：对于需要移植的供体和受体，手术前8 h禁食不禁水，对大鼠进行麻醉，麻醉后在大鼠背部加垫，使其呈仰卧位，在大鼠腹部正中位置行十字切口，开腹，用血管钳固定腹腔，切断并清除掉肝脏周围暴露出的血管，结扎左隔下静脉，并将二者离断；按压肠管，使其向大鼠左下腹倾斜，分离并切断肝脏周围的韧带，然后结扎血管，将手术刀顺时针旋转，注意避免肝脏周围组织受损，使肝脏充分游离，同时游离肝上肝下腔静脉、门静脉和胆总管等。从肝下下腔静脉注入2 mL肝素钠液 (肝素钠125 μ/mL)使SD大鼠全身肝素化[4]。在距离肝门1cm的位置切开胆管前壁，用插入硬膜外导管的方式固定胆管；从门静脉置管原位灌注冬虫夏草联合丹参器官保存液和4℃的UW液，以3 mL/min的流速经肝脏原位灌注30 min，阻断肝上肝下腔静脉，为开辟一输出道使灌出液输出，在肝下下腔静脉前壁切开一小口，等到肝脏完全变为土黄色，切断各血管并结扎肝上下静脉，再将肝脏取出，放入保存液中保存，设定保存液保存温度为4℃。两组实验在保存结束后经门静脉留置管以8 mL/min的灌注量再灌注恒温37℃的乳酸钠林溶液30 min。离体结束后，检测两组大鼠的胆汁分泌量以及保存液的pH值和渗透压，观察两组保存液的保存效果以及移植后器官的存活率。

1.2.2 研究组制作方法 研究组中采用冬虫夏草联合丹参器官保存液对大鼠肝脏进行保存，具体制作过程如下：①取得100 g丹参，加入8倍量的水，在浸泡2.5 h后煎煮1.5 h，过滤渣后重复以上操作2次，每次1 h，滤过合并滤液，滤液浓缩后至1 L，备用。②首先将8 g新鲜秘制的虫草干粉样品倒入蒸馏水中，在30℃的恒温条件下浸泡3 h，12 000 r/min离心15 min，得到液体A，把剩下的药渣放入250 mL的玻璃容器中，再加入150 mL的蒸馏水并在56℃的水浴中进行4 h的回流，经冷却并采用简单的过滤，除去药渣后经0.45 μm混合纤维素酯膜滤器过滤除菌得到液体B。混合两种液体配置成250 mL冬虫夏草液[5]。制成后，按照国际标准器官保存液准则在干燥清洁的条件下配置冬虫夏草联合丹参器官保存液，并于在室温为20～24℃按1 000 mL的量配置。制作大鼠离体灌注模模型同上。

1.3 观察标准

测定两组保存液的胶体渗透压和pH值；对大鼠进行立体灌注后，通过胆管置管采集各肝脏标本再灌注30 min内分泌的胆汁，用手动分液器测量分泌的胆汁量，并做好相关记录。

1.4 统计方法

数据应用SPSS 18.0统计学软件进行分析，计量资料以（±s）表示，行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

研究组与对照组中的两种保存液其pH值和渗透压值相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两种保存液的pH值和渗透压值对比（±s）

表1 两种保存液的pH值和渗透压值对比（±s）

m o l/L）1 0.9 5 1 1.0 3 1 5

研究组中的离体大鼠随着时间的延长所分泌的胆汁量越少，且胆汁的分泌量明显少于对照组中的大鼠（P＜0.05）。 见表 2。

表2 两组离体SD大鼠肝脏保存不同时间后再灌注胆汁分泌量[（±s），μL]

表2 两组离体SD大鼠肝脏保存不同时间后再灌注胆汁分泌量[（±s），μL]

组别4 h 8 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h对照组（n=4 3）研究组（n=4 3）t值P值1.6 7±0.0 3 1.9 7±0.1 2 1 3.2 9 4＜0.0 5 2.3 4±0.2 1 2.2 3±0.1 3 1 3.3 9 1＜0.0 5 2.7 5±0.1 1 2.6 7±0.2 1 1 5.1 2 5＜0.0 5 3.0 1±0.0 4 2.8 6±0.0 9 1 7.9 3 5＜0.0 5 3.2 8±0.5 6 3.1 7±0.0 9 1 5.6 9 3＜0.0 5

3 讨论

器官保存液的出现极大的促进了临床医学器官移植手术的发展和推广，UW液是目前国内比较常用的器官保存液，保存时间较长，且大大提高了离体器官的质量，为器官的移植和移植后的成功率做出了很大的贡献[6]。该文充分利用中药资源，根据冬虫夏草和丹参的药理性质，配置成冬虫夏草联合丹参器官保存液，以健康的SD大鼠作为实验对象，对比分析了冬虫夏草联合丹参器官保存液和UW液对大鼠肝脏的保存效果，监测两种保存液的PH值和渗透压以及两组大鼠所分泌的胆汁量，从而得出相应的结论[7]。

该次研究中所有的离体活体实验都在保存液配置成功后一周内进行，研究表明应用冬虫夏草联合丹参器官保存液经过一周的监测后其指标与UW液并无明显差异，有一定的缓冲能力，有效防止酸中毒：虽然肝脏在离体后会流失一定的血量，但是其细胞内的代谢并未停止，许多代谢产物的累积使氢离子的浓度升高，从而保存液的pH值会发生变化，临床器官移植上保存液pH值与器官细胞pH值密切相关，保存液pH值的变化能进一步反映出肝细胞pH值的变化。通常来说，使肝细胞能发挥较好的功能，必须要将肝细胞的pH值稳定在7.5左右，因此保持器官保存液的缓冲能力对防止酸中毒起到非常重要的作用[8]。结果显示，所配置的冬虫夏草联合丹参器官保存液与UW液相比pH值无显著差异，研究组中保存液的pH值和渗透压分别为（7.41±0.56）和（325.09±11.03）mmol/L，与对照组中UW保存液的pH值和渗透压相比差异无统计学意义，证实了其具有强大的缓冲能力，能有效防止酸中毒，随着保存时间的延长，两组大鼠肝脏器官胆汁分泌量逐渐减少，且短期内研究组胆汁分泌量与较相同时期的对照组相比，分泌量差异有统计学意义，随着时间的不断延长，研究组胆汁分泌量比对照组研究组胆汁分泌量要更少一些，进一步说明冬虫夏草联合丹参器官保存液对肝脏器官的保护作用更好一些，有效防止组织坏死[10]。张佳伟等人[9]采用大鼠模型(IPRL)，加入不同剂量冬虫夏草，记录胆汁流出量，结果提示冬虫夏草组的胆汁分泌(172.95±12.7)μL 明显高于对照组(98.68±5.5)μL(P＜O.01)，门冬氨酸转氨酶(AST)(38.87±12.66)U/L明显低于保存对照组 (145.I2±8I.56)U/L[9]。

有个别研究中去掉了UW液中的青霉素、胰岛素等成分后无明显影响，该次研究中研制的新型保存液改用色氨酸，最终能生成ATP，为缺血细胞再灌注能量，防止了细胞再灌注遭受损伤，促进了细胞的新陈代谢。此外，该项实验所建立的SD大鼠非循环离体灌注模型便于观察，简单且容易操作，有利于实验的顺利进行[10]。为保护细胞结构不受损坏，冬虫夏草联合丹参器官保存液中应用高镁抑制细胞内的钙超载,防止器官缺血损伤,利于促进器官功能的恢复。加入冬虫夏草和丹参能起到拮抗氧自由基、抗氧化、和缺血再灌注损伤的作用，二者相结合有利于促进对细胞膜的完整性保护[11]。此外，该次实验的过程中，应检查静脉切口是否过大，是否与静脉套管接口吻合；实验时根据大鼠体重予以麻醉剂量；取出肝脏时注意防止出血；注意对大鼠的保暖等[12]。

综上所述，就对离体SD大鼠肝脏的保存效果来看，研制的冬虫夏草联合丹参器官保存液与UW液保存效果相近，在灌注后肝细胞胆汁分泌方面略优于UW液，冬虫夏草联合丹参器官保存液对SD大鼠肝脏的保存效果较好，在临床上值得进一步推广。