鸡GM-CSF和IL-2增强表达新城疫病毒F蛋白的重组杆状病毒疫苗的免疫效果

于航，高冬妮，申燕，刘颖，平文祥，葛菁萍



鸡GM-CSF和IL-2增强表达新城疫病毒F蛋白的重组杆状病毒疫苗的免疫效果

于航，高冬妮，申燕，刘颖，平文祥，葛菁萍

黑龙江大学 生命科学学院 微生物省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080

于航, 高冬妮, 申燕, 等. 鸡GM-CSF和IL-2增强表达新城疫病毒F蛋白的重组杆状病毒疫苗的免疫效果. 生物工程学报, 2018, 34(9): 1442–1452.Yu H, Gao DN, Shen Y, et al. Efficacy enhancement of a Baculovirus-vectored Newcastle Disease Virus F protein vaccine by chicken GM-CSF and IL-2. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1442–1452.

为比较鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF) 及鸡白细胞介素2 (Interleukin 2，IL-2) 对杆状病毒疫苗的免疫增强效果，通过基因工程手段构建重组杆状病毒疫苗 (Recombinant Baculovirus，BV) rBV-LMI-F，并联合GM-CSF及IL-2进行鸡体免疫。对中和抗体水平及细胞因子含量比较GM-CSF和IL-2的免疫增强效果进行对比。结果显示，在第一次免疫28 d或42 d后，GM-CSF联合免疫组可诱导鸡体产生更高的抗体和细胞因子水平 (0.01)。表明鸡GM-CSF能更有效地刺激机体产生较强的抗体和细胞因子反应，提高重组杆状病毒疫苗的免疫效果。

新城疫，GM-CSF，IL-2，联合免疫，免疫效果

新城疫 (Newcastle disease, ND) 是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV) 引起的高度接触性传染病，由于该病的暴发及抗原变异等情况相继出现，使得传统疫苗免疫效果日趋下降而濒临于历史舞台“边缘”[1]。针对这种情况，开发基因工程亚单位疫苗成为解决该疫病的方法之一。杆状病毒表达系统是一种操作简便、收益高、表达产物稳定的高效的真核表达载体系统，可用于制备新型疫苗以对抗禽类传染病的暴发[2-3]。并且各类疫苗在添加免疫佐剂后其免疫效果得到提高[4-5]。研究表明，F蛋白是NDV感染所必需的蛋白，其在病毒颗粒与宿主细胞融合过程中发挥重要作用[6]。本课题组前期采用DNAMAN、DNAStar和ABCpred等预测软件对NDV-F蛋白抗原表位指数、亲水性、疏水性和二级结构进行了综合预测，我们根据预测结果选取第1−196位氨基酸与第331−554位氨基酸片段作为抗原片段来研究基因的抗原性并分别构建重组杆状病毒疫苗。鸡体免疫结果显示，含有全基因的杆状病毒疫苗可获得最佳的免疫保护效果[7]，因此本研究以全基因为目的基因构建重组杆状病毒疫苗，以保护鸡体免受病毒攻击。

但基因工程亚单位疫苗通常因分子量小等因素而不能完全发挥其免疫效果，因此需要通过添加一定的免疫佐剂提高其免疫效果[8]。在众多类型免疫佐剂中，GM-CSF和IL-2对各类免疫细胞具有较强的免疫刺激作用。且具有较为广泛的应用前景而逐渐进入研究者们的视线。其中，GM-CSF是一种重要的造血生长因子和免疫调节因子[9]，不仅能够促进粒细胞和单核/巨噬细胞形成集落，还可诱导抗原呈递细胞到达抗原入侵部位对抗原进行呈递，同时也在树突状细胞前体细胞分化中起关键作用[10]。IL-2作为细胞因子可增强单核细胞及NK细胞的杀伤活性[11]，同时促进T、B淋巴细胞的增殖和分化，从而发挥抗病毒作用[12]。并且研究者们已经证实重组IL-2具有较强的免疫刺激作用和免疫协同作用[13]。

此外，人们为增强杆状病毒疫苗的保护效率，筛选高效的免疫佐剂亦为重中之重。因此，人们将研究重点逐渐转向对免疫佐剂的研究。本文自主构建重组杆状病毒疫苗 (rBV-LMI-F)，并联合免疫刺激剂CSF及IL-2进行鸡体免疫。通过对比各组鸡只的抗体水平及细胞因子含量，从GM-CSF和IL-2中筛选出最佳免疫刺激剂，为NDV疫苗免疫刺激剂的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

SPF鸡：80只1日龄白来航鸡均由哈尔滨兽医研究所提供，饲养于隔离器中用于鸡体免疫试验；国家标准速发型NDV强毒株F48E9购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，用于攻毒试验；Sf9昆虫细胞由本实验室冻存，用于重组杆状病毒滴度测定。

1.2 供试质粒

本研究所用的杆状病毒骨架质粒pLMI及携带目的基因的原始质粒pT-F和pT-IL-2由本实验室前期自主构建，pUC-GM-CSF购自哈尔滨金凯瑞公司，上述质粒用于构建重组杆状病毒rBV-LMI-F、rBV-LMI-GM-CSF与rBV-LMI-IL-2。

1.3 试剂盒

CellTiter 96®Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay购自Promega公司；鸡新城疫病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒、IFN-gELISA检测试剂盒、IL-2 ELISA检测试剂盒和鸡IL-4 ELISA检测试剂盒购自Abcam公司。

1.4 方法

1.4.1 引物设计

根据及基因序列设计PCR引物，引物见表1。

表1 本研究所用的引物序列

Enzyme restriction sites are underlined.

1.4.2 杆状病毒载体的构建

将载体pLMI与pT-F/pUC-GM-CSF/pT-IL-2分别进行Ⅰ/Ⅰ、Ⅰ/RⅠ和RⅠ/Ⅰ双酶切，并与pLMI载体相连接，构建重组转移质粒pLMI-F、pLMI-GM-CSF与pLMI-IL-2。将获得的重组质粒转入DH5α感受态细胞中，挑取白色单菌落，提取质粒DNA，并对其进行双酶切验证。验证正确后将重组转移质粒转入DH10 Bac感受态细胞中，筛选阳性重组子提取Bacmid DNA，并命名为rBac-LMI-F、rBac-LMI- GM-CSF与rBac-LMI-IL-2。最后分别以rBac-LMI-F、rBac-LMI-GM-CSF与rBac-LMI-IL-2为模板，以F-up/F-down、GM-CSF-up/GM-CSF-down、IL-2-up/IL-2-down和M13-47为上下游引物进行PCR，鉴定杆状病毒转移载体是否构建成功。

1.4.3 重组杆状病毒的制备

本研究通过脂质体培养法制备重组杆状病毒，首先将上述3种杆状病毒转移载体rBac-LMI-F、rBac-LMI-GM-CSF与rBac-LMI-IL-2转染Sf9昆虫细胞，当80%细胞病变时收集共转染上清液，如此重复3次，以获得高效价P3代重组杆状病毒，并分别命名为rBV-LMI-F、rBV-LMI-GM-CSF和rBV-LMI-IL-2。最后以构建完成的杆状病毒为模板，以F-up/F-down、GM-CSF-up/GM-CSF-down、IL-2-up/IL-2-down为上下游引物进行PCR，验证目的基因是否整合至重组杆状病毒中。

1.4.4 重组杆状病毒的滴度测定

本研究通过测定重组杆状病毒滴度确定免疫剂量，将Sf9昆虫细胞接种至6孔板中，并向其分别加入经10倍连续稀释的rBV-LMI-GM-CSF和rBV-LMI-IL-2病毒液，1 h后弃去病毒液，加入含0.9%低熔点琼脂的Sf900 Ⅱ SFM培养液，27 ℃孵育8 d，最后使用中性红染色，通过试验所得蚀斑数量测定重组杆状病毒rBV-LMI-GM-CSF和rBV-LMI-IL-2滴度，并以此滴度进行鸡体免疫。

1.4.5 免疫及攻毒程序

将14日龄SPF鸡随机分为4组，每组20只，免疫分组、剂量、接种途径见表2。当免疫鸡只日龄为14日龄时，对各免疫组鸡只进行第一次免疫；隔7 d进行第二次免疫 (0.2 mL/只)；42日龄时采用NDV标准强毒株F48E9以皮下注射方式对各免疫组鸡只攻毒，攻毒剂量为200 μL/只。攻毒后观察鸡采食量、饮水量、粪便和精神状况等生理变化。

表2 鸡体免疫分组

1.4.6 组织收集及病理组织切片分析

攻毒后7 d，各免疫组随机选取一只SPF鸡进行麻醉并断头处死，提取免疫鸡只心脏及十二指肠组织，混于多聚甲醛溶液过夜，然后使用EDTA脱钙液体脱钙1周。包埋后通过切片机将组织切成8 μm厚的截面，用于病理组织切片分析。

1.4.7 免疫鸡血清中和试验

分离免疫鸡血清，梯度稀释NDV强毒株及血清，然后使病毒与血清中和反应1 h，接种至鸡胚成纤维细胞，37 ℃、5% CO2培养96 h，每12 h记录细胞病变情况，按Reed-Muench法计算出每个血清样品的中和保护价 (Protective dose，PD50)，用SSPS软件计算每组血清PD50的几何平均数，即为该日龄血清的中和抗体效价 (Geometric mean titer，GMT)。

1.4.8 免疫鸡血清IgG抗体水平的检测

在免疫0、14、28、42、56 d后每组随机选取6只采取翅静脉血，每只0.5−1.0 mL，4 000 r/min离心15 min分离血清，应用新城疫IgG抗体ELISA试剂盒检测免疫后各组血清样本中IgG抗体滴度，具体方法按照ELISA检测试剂盒说明书进行。

1.4.9 免疫鸡血清细胞因子的检测

所有免疫鸡在免疫后0、14、28、42、56 d后随机翅静脉采血6只，每只0.5−1.0 mL，离心分离血清，应用IFN-γ、IL-2和IL-4 ELISA试剂盒检测各免疫组鸡只血清样本中IFN-γ、IL-2和IL-4浓度，具体方法按照ELISA检测试剂盒说明书进行。

1.4.10 统计学分析

2 结果与分析

2.1 重组转移载体pLMI-F、pLMI-GM-CSF和pLMI-IL-2的构建与鉴定

将载体pLMI、pT-F、pUC-GM-CSF和pT-IL-2分别进行酶切后，将载体片段与目的片段连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒进行酶切验证，凝胶电泳检测结果表明重组转移载体pLMI-F、pLMI-GM-CSF和pLMI-IL-2构建成功。

2.2 重组穿梭转移载体rBac-LMI-F、rBac- LMI-GM-CSF和rBac-LMI-IL-2的鉴定

将构建成功的重组转移载体转化DH10 Bac感受态细胞，提取Bacmid DNA，进行PCR验证，凝胶电泳结果显示在预期处均有明显条带 (4 000、2 800、2 800 bp)，表明重组穿梭转移载体rBac-LMI-F、rBac-LMI-GM-CSF和rBac-LMI-IL-2构建成功。

2.3 重组杆状病毒rBV-LMI-F、rBV-LMI- GM-CSF和rBV-LMI-IL-2的PCR鉴定

将构建完成的重组穿梭载体rBac-LMI-F、rBac-LMI-GM-CSF和rBac-LMI-IL-2转染Sf9昆虫细胞，收集上清液制备P1代重组杆状病毒，并进行PCR鉴定，电泳结果显示在预期处均有明显条带 (1 662、435、430 bp)，表明目的基因已成功整合到重组杆状病毒基因组中，重组杆状病毒rBV-LMI-F、rBV-LMI-GM-CSF和rBV-LMI-IL-2构建成功。

2.4 重组杆状病毒滴度测定

利用空斑分析法测定P3代重组杆状病毒滴度，观察至空斑数不变后计数，计数前用中性红溶液染色2 h，观察空斑形态并计数，得到rBV-X P3代的重组病毒滴度 (表3和图1)。

2.5 免疫鸡只攻毒保护率

各免疫组鸡只在初次免疫和加强免疫后均表现正常。在攻毒2 d后开始出现死亡，空白对照组鸡只发病率为71.4%，同时本课题组在剖检鸡只后发现各免疫组鸡只的心脏及十二指肠均有不同程度的出血和充血现象，说明NDV对免疫鸡只具有较强的毒性，并可致其死亡。而rBV-LMI-F单独免疫组和rBV-LMI- F+rBV-LMI-IL-2联合免疫组在攻毒4 d后才陆续有少量鸡只死亡，而rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM- CSF联合免疫组的免疫鸡只则全部存活。同时在攻毒后第8天剖检GM-CSF和IL-2联合免疫组鸡只，未发现其心脏与十二指肠出现大规模出血与充血现象。并且在GM-CSF和IL-2的免疫协同作用下，rBV-LMI-F+ rBV-LMI-GM-CSF/IL-2联合免疫组攻毒保护率分别达到100%和85.7%，与rBV-LMI-F单独免疫组 (80%) 相比，差异显著(0.05)，同时rBV-LMI- F+rBV-LMI-GM-CSF联合免疫组攻毒保护率较rBV-LMI-F+rBV-LMI-IL-2联合免疫组提高了14.3%，且差异显著 (0.05)。表明GM-CSF与IL-2虽均具有较强的免疫协同作用，但相比于IL-2来说，GM-CSF具有更强的免疫刺激效果 (图1)。同时排毒情况显示，PBS对照组病毒分离为阳性，而rBV-LMI-F单独免疫组和rBV-LMI- F+rBV-LMI-GM-CSF/IL-2联合免疫组病毒分离均为阴性，且盲传1代后亦为阴性。

表3 P3代重组杆状病毒rBV-X滴度测定

图1 免疫鸡只攻毒保护结果

2.6 病理学分析

2.6.1 免疫鸡只病理组织定性分析

根据病理组织切片结果显示，GM-CSF联合免疫组鸡只的十二指肠则无明显病理变化；且IL-2联合免疫组鸡只的十二指肠的肠黏膜部分有少量脱落，而PBS及rBV-LMI-F对照组免疫鸡只的十二指肠的肠粘膜表面上皮脱落且多处呈枣核状紫红色出血点，大部分组织结构被破坏。另外在心肌纤维方面，GM-CSF联合免疫组鸡只的心肌纤维完好无损，无明显病理变化；同时IL-2联合免疫组鸡只的心肌纤维局部有轻微的小灶状出血，而PBS及rBV-LMI-F对照组免疫鸡只的心肌纤维明显断裂，存在大量出血点及出血斑 (图2、图3)。表明相对于IL-2来说，GM-CSF具有较强的免疫协同作用，可有效增强重组杆状病毒对鸡体的保护能力。

图2 各免疫组鸡只的十二指肠病变情况 (200×)

图3 各免疫组鸡只的心肌病变情况(200×)

2.6.2 免疫鸡只病理组织定量分析

为深入分析GM-CSF与IL-2在协助重组杆状病毒疫苗对鸡体器官组织保护方面的能力强弱，本研究通过Image J软件测定免疫鸡组织内肠上皮脱落与心肌纤维断裂部分面积的大小，对病理组织切片进行定量分析，以评价GM-CSF与IL-2的免疫协同作用。

结果表明，PBS空白对照组、rBV-LMI-F、GM-CSF共免疫组及IL-2共免疫组免疫鸡只十二指肠内场上皮脱落面积分别为25 830、11 541、2 079、5 086 μm2，其中GM-CSF共免疫组十二指肠内肠上皮脱落面积最小，且与其余各免疫组相比均差异显著 (0.05)。同时，PBS空白对照组、rBV-LMI-F、GM-CSF共免疫组及IL-2共免疫组免疫鸡只心肌纤维断裂部分面积分别为13 227、9 248、1 058、2 865 μm2，其中GM-CSF共免疫组十二指肠内肠上皮脱落面积最小，且与其余各免疫组相比均差异显著 (0.05)，表明相对于IL-2，GM-CSF可协助重组杆状病毒疫苗对鸡体组织提供更好的保护。

2.7 免疫鸡血清中和抗体效价测定

各免疫组鸡只免疫血清中中和抗体效价均呈现先升高后降低的趋势，且在第一次免疫后28 d达到最高 (图4)，rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF及rBV-LMI-F+rBV-LMI-IL-2联合免疫组免疫鸡血清中中和抗体效价分别为1 575.84及1 457.83，与rBV-LMI-F单独免疫组 (1 329.78) 相比，差异极显著 (0.01)，表明GM-CSF与IL-2均能对重组杆状病毒疫苗起到免疫增强的协同作用。同时，rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF联合免疫组免疫鸡血清中中和抗体效价较rBV-LMI-F+rBV- LMI-IL-2联合免疫组高8.1%，且差异极显著(0.01)，表明与IL-2相比，GM-CSF能够对重组杆状病毒疫苗起到更强的免疫增强的协同作用。

图4 各免疫组鸡血清中中和抗体效价

2.8 免疫鸡血清中特异性IgG抗体水平

自首免后，各免疫组鸡血清中IgG水平均呈现先升高后降低的趋势，且于第一次免疫后42 d达到最高，其中rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF联合免疫组鸡血清中IgG抗体水平较BV-LMI-F单独免疫组提高了25.7%，差异显著 (0.05)，而rBV-LMI-F+rBV-LMI-IL-2联合免疫组较rBV- LMI-F单独免疫组仅提高了13.8%。同时GM-CSF联合免疫组鸡血清中IgG抗体水平较IL-2联合免疫组提高了10.49%，且差异显著 (0.05)，表明相对于IL-2而言，GM-CSF能够刺激鸡体产生较高水平体液免疫应答，此结果与攻毒保护率相符 (图5)。

2.9 免疫鸡血清中IFN-γ含量

首免后，各免疫组鸡只血清中IFN-γ含量随时间延长而逐渐升高，至第一次免疫后42 d，各组IFN-γ含量达到最大 (图6)。其中rBV-LMI-F+ rBV-LMI-GM-CSF/IL-2联合免疫组鸡只血清中IFN-γ含量 (78.10、73.01 ng/mL) 与rBV-LMI-F单独免疫组 (59.53 ng/mL) 相比差异极显著 (0.01)。而rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF联合免疫组鸡只血清中IFN-γ含量较rBV-LMI-F+ rBV-LMI-IL-2联合免疫组提高了7.0%，且差异极显著 (0.01)，表明GM-CSF与IL-2均能刺激鸡体产生较强的细胞免疫应答。

图5 各免疫组鸡血清中特异性IgG抗体水平

图6 各免疫组鸡血清中IFN-γ含量

2.10 免疫鸡血清中IL-2及IL-4含量

各免疫组鸡只血清中IL-2及IL-4含量均呈现先升高后降低的趋势，至第一次免疫后56 d时达到最高，且rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF/IL-2联合免疫组与rBV-LMI-F单独免疫组相比，差异极显著 (0.01)。其中，rBV-LMI-F+rBV-LMI- GM-CSF联合免疫组血清中IL-2及IL-4含量较rBV-LMI-F+rBV-LMI-IL-2联合免疫组分别提高了10.74%和21.4%，且均差异极显著 (0.01)。结果表明，相对于IL-2来说，GM-CSF能够诱导鸡体产生更强的系统性免疫应答，对鸡体提供更好的保护 (图7、图8)。

图7 各免疫组鸡血清中IL-2含量

图8 各免疫组鸡血清中IL-4含量

3 讨论

目前人们对于NDV的防控主要以传统疫苗为主，虽然也开始利用基因工程亚单位疫苗进行尝试，但是也或多或少出现了一些弊病，例如重组杆状病毒疫苗的免疫效果会受外源基因表达时间的限制[14-15]，并且变异株的出现使疫苗免疫效果下降[16-18]，而单一使用疫苗也很难将病毒根除[19-20]。因此，联合免疫刺激剂来增强重组杆状病毒疫苗的免疫效果成为有益的选择[21-22]。

目前，在众多免疫刺激剂中，GM-CSF和IL-2对各类免疫细胞具有较强的免疫刺激作用。王兴龙等[23]在探究GM-CSF作用效果时发现，其可刺激鸡骨髓细胞快速形成集落。姜永厚等[24]在构建重组质粒并联合F基因疫苗进行鸡体免疫研究IL-2的免疫效果作用时亦得到相似结论。

虽然鸡GM-CSF和IL-2具有作为免疫刺激剂的应用前景，但对于两者免疫增强效果的比较方面的研究还鲜有报道，且两者对于NDV的响应水平及对杆状病毒疫苗的免疫协同效果还不为人所知[25]。因此本研究以此为切入点，以GM-CSF和IL-2为免疫刺激剂进行鸡体免疫，对比分析两者的免疫增强效果。

免疫鸡只攻毒保护率结果表明，rBV-LMI-F+ rBV-LMI-GM-CSF联合免疫组攻毒保护率和中和抗体含量较IL-2联合免疫组提高了14.3%，差异显著 (0.05)，且Sedegah等[26]在探究GM-CSF与pPyCSP免疫协同作用时得出相似结果，即两者混合免疫后机体内pPyCSP特异性抗体水平提高了8倍，表明GM-CSF可提高多类基因工程疫苗的免疫效果，且不仅局限于禽类疫苗中，其可突破种属限制并发挥较强的免疫刺激作用，同时本研究也为GM-CSF在其余病例中的应用提供新思路。

此外，rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF联合免疫组鸡只器官并无明显病变，而rBV-LMI-F+rBV- LMI-IL-2联合免疫组鸡只器官有明显出血点和血斑出现，表明GM-CSF可增强杆状病毒疫苗对鸡体的保护效果，GM-CSF可能通过激活某种信号转导通路以修复受损组织避免鸡体死亡，从侧面提高疫苗的免疫保护效率。另一方面，本研究发现GM-CSF联合免疫组鸡只免疫血清中中和抗体及特异性IgG抗体水平较IL-2联合免疫组分别提高了5.5%和11.8%，且均差异显著 (0.05)，表明GM-CSF能够刺激鸡体产生较强的体液免疫应答，进而协助重组杆状病毒疫苗提高对鸡体的保护效率。同时，GM-CSF联合免疫鸡血清中IFN-γ、IL-2及IL-4含量均高于IL-2联合免疫组，且均差异显著 (0.05)。Du等[27]在探究GM-CSF的免疫协同作用时亦发现，GM-CSF可协助重组疫苗提高机体内IL-2、IL-4和IFN-γ等细胞因子的含量，另外谭兵等[28]亦得到相似结果，表明GM-CSF不仅对免疫细胞具有较强刺激作用，对机体的体液及细胞免疫亦具有较强的刺激作用，至于其是否可激活某种信号转导通路还需进一步探究。

综上所述，本研究在尝试构建杆状病毒载体疫苗并进行鸡体免疫后，明确了GM-CSF作为免疫刺激剂的免疫协同效果，发现GM-CSF可不受种属限制，GM-CSF亦可协助疫苗突破机体组织屏障，保护机体组织不受病毒侵害以发挥其较强的免疫协同作用。本研究不仅为NVD的制备奠定基础，同时也为GM-CSF的应用领域及免疫增强机制方面的探究提供新的研究思路。

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(本文责编 陈宏宇)

Efficacy enhancement of a Baculovirus-vectored Newcastle Disease Virus F protein vaccine by chicken GM-CSF and IL-2

Hang Yu, Dongni Gao, Yan Shen, Ying Liu, Wenxiang Ping, and Jingping Ge

Key Laboratory of Microbiology,College of Life Sciences,Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China

To compare with the effects of the GM-CSF and IL-2 used as adjuvants in the baculovirus vaccine, we used genetic engineering to construct the recombinant baculovirus rBV-LMI-F and with GM-CSF and IL-2 to immunized chickens. Then, we compared the concentration of the neutralizing antibody and cytokines to determine the immunostimulatory effects of GM-CSF and IL-2. GM-CSF induced higher levels of antibodies and cytokines in chickens at 28 d and 42 d post-vaccination. In conclusion, GM-CSF could elicit higher serum antibody and cytokines responses and improved the effects of Baculovirus vaccine.

Newcastle disease,GM-CSF, IL-2, co-immunization, immune effect

December 21, 2017;

May 28, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31270143), Colleges and Universities Science and Technology Innovation Team of Heilongjiang Province “Technology of Agricultural Microbial Fermentation” (No. 2012td009).

Jingping Ge. Tel: +86-451-86609016; E-mail: gejingping@126.com

国家自然科学基金 (No. 31270143)，黑龙江省高等学校科技创新团队“农业微生物发酵技术” (No. 2012td009) 资助。

2018-06-21

10.13345/j.cjb.170505

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180620.1617.002.html