TRIM1、occludin、ZO-1 在结肠癌组织中的表达及临床意义

纪伟平 卢明东 黄颖鹏 王娟 杨向群

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤[1]。细胞极性紊乱或丧失是结肠癌发生、发展过程中的重要病理改变[2]。在细胞极性丧失的肿瘤细胞恶变过程中，往往伴有细胞极性蛋白如occludin、ZO-1等表达下调[3]。三结构域蛋白（TRIM）含有3个特征性结构域，即1个锌指结构域、1或2个锌离子结构域和1个卷曲螺旋结构域，一般发挥E3泛素连接酶功能[4-6]，在天然免疫应答、细胞分化、转录调节、细胞骨架重塑、发育、细胞周期和凋亡、DNA损伤修复等生理过程中起着重要作用[7]。TRIM异常通过调节基因表达、细胞增殖、DNA损伤修复和凋亡等信号通路在癌症中发挥作用[8]，还通过调控NF-κB信号通路在炎症向癌症发展过程中发挥作用[9-10]。TRIM1是TRIM家族的重要一员，目前尚无关于TRIM1在结肠癌中表达及与occludin、ZO-1表达关系的相关报道。因此，本研究检测TRIM1、occludin、ZO-1在结肠癌组织中的表达，同时分析3者间的相关性以及与结肠癌患者临床特征和预后的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2011年1月至2013年1月温州医科大学附属第二医院收治的120例结肠癌患者手术切除的癌组织及其癌旁正常组织标本为研究对象。其中男65例，女 55 例；年龄 14～80[61（54，67）]岁；参照 WHO 组织学分类标准，确定病理类型均为腺癌非特殊型；分化程度：高分化16例，中分化71例，低分化33例；参照国际抗癌联盟（UICC）提出的临床分期标准：Ⅰ期30例，Ⅱ期32例，Ⅲ期58例；肿瘤浸润深度：T1期24例，T2期37例，T3期50例，T4期9例；淋巴结转移93例，无淋巴结转移27例；均无远处转移；术前均未接受过新辅助化疗。本研究经医学伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 遵循无菌原则取材，所取组织用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，免疫组化染色采用S-P法检测。标本切片依次经过脱蜡、水化、抗原修复（采用酸修复）、3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶等处理；采用免疫组化S-P法通用型染色试剂盒进行染色；阳性部位呈棕褐色。所加一抗（兔抗人TRIM1和鼠抗人occludin、鼠抗人ZO-1单克隆抗体）均购自R&D公司，DAB显色剂购自武汉博士德公司。

1.2.2 染色结果的判断 由2位病理科医师在显微镜下观察，根据阳性染色范围及程度进行评分。采取阳性染色面积与染色强度的评分相乘方式，每个切片重复观察5个高倍视野。阳性染色面积赋值：＜1%为0分，1%～30%为1分，＞30%～50%为2分，＞50%为3分；染色强度赋值：弱阳性为1分，阳性为2分，强阳性为3分。将5个高倍视野的染色面积评分均值与染色强度评分均值相乘，即表达评分。表达评分＞4分为高表达，≤4分为低表达。

1.3 评估指标 比较结肠癌组织及癌旁正常组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达水平，并分析结肠癌组织中TRIM1表达与occludin、ZO-1表达的相关性。收集结肠癌患者性别、年龄、肿瘤部位、临床分期、分化程度、T分期、淋巴结转移与TRIM1、occludin、ZO-1表达的关系；同时分析TRIM1、occludin、ZO-1表达与结肠癌患者预后的关系。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用配对样本t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。结肠癌组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达的相关性分析采用Spearman秩相关。采用Kaplan-Meier法绘制结肠癌组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达高、低者的生存曲线，并进行logrank检验。采用Cox比例风险回归模型分析结直肠癌患者术后5年总生存的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织及其癌旁正常组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达评分比较 结肠癌组织中TRIM1表达评分为（4.37±1.83）分，明显高于癌旁正常组织的（3.72±1.98）分，差异有统计学意义（t=2.64，P＜0.05）；结肠癌组织中occludin表达评分为（3.09±1.71）分，明显低于癌旁正常组织的（3.53±1.65）分，差异有统计学意义（t=2.03，P＜0.05）；结肠癌组织中ZO-1表达评分为（3.22±2.07）分，明显低于癌旁正常组织的（3.75±1.23）分，差异有统计学意义（t=2.41，P＜0.05），见图 1。

图1 TRIM1、occludin、ZO-1在结肠癌组织及其癌旁正常组织中的表达（免疫组化染色，×200）

2.2 结肠癌组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达的相关性 结肠癌组织中TRIM1表达与occludin、ZO-1表达均呈负相关（rs=-0.420、-0.343，均 P＜0.05），见表 1。

表1 结肠癌组织中TRIM1、occludin、ZO-1高低表达的交叉表（例）

2.3 结肠癌组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达与临床特征的关系 结肠癌组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达与肿瘤临床分期、分化程度、T分期、是否淋巴结转移等有关（均P＜0.05），与患者性别、年龄、肿瘤部位等均无关（均P ＞0.05），见表2。

表2 结肠癌组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达与临床特征的关系[例（%）]

2.4 结肠癌组织中TRIM1、occludin、ZO-1表达与患者预后的关系 120例结肠癌患者均获得术后5年完整的随访信息。经生存分析，TRIM1高、低表达者平均生存时间分别为（45.06±50.55）、（56.24±59.47）个月；TRIM1 高表达者5年累积生存率为35.2%，明显低于TRIM1低表达者的 85.7%（χ2=29.31，P＜0.05），见图 2a（插页）。occludin高、低表达者平均生存时间分别为（54.54±59.16）、（46.90±51.98）个月；occludin 高表达者 5 年累积生存率为 82.5%，明显高于occludin低表达者的42.5%（χ2=15.66，P＜0.05），见图2b（插页）。ZO-1高、低表达者平均生存时间分别为（54.13±59.69）、（47.55±52.32）个月；ZO-1高表达者5年累积生存率为82.4%，明显高于ZO-1低表达者的45.3%（χ2=12.38，P＜0.05），见图 2c（插页）。经Cox比例风险回归模型分析，TRIM1高表达是影响结肠癌患者术后5年总生存的独立危险因素（HR=2.374，95%CI：1.04～5.44，P＜0.05）。

3 讨论

随着对肿瘤认识的不断加深，学者对肿瘤相关因子的研究逐渐从单一分子向家族分子或序贯式关联分子群转变。在肿瘤发生、发展过程中，并非由单一分子发挥作用，大部分是由众多分子相互作用进而传递分子信号，从而产生相应的细胞或生物行为。本研究结果发现结肠癌组织中TRIM1表达明显升高，occludin、ZO-1表达明显降低；TRIM1表达与occludin、ZO-1表达呈负相关。此外，本研究发现TRIM1、occludin、ZO-1蛋白表达与肿瘤临床分期、分化程度、T分期、是否淋巴结转移等有关；TRIM1高表达是影响结肠癌患者术后5年总生存的独立危险因素。

细胞极性是正常细胞功能建立与维持的关键，它是细胞形态、细胞中某些胞质成分、细胞表面信号分子、细胞器及细胞骨架等生理组织结构按一定空间顺序不均等分布以及细胞行使功能的不对称性[11-16]。紧密连接作为一个封闭的屏障，具有保持细胞极性及稳态、调节上皮细胞通透性的作用，是上皮细胞极性建立与维持的重要细胞结构[17]。一般认为，上皮细胞紧密连接的形成意味着细胞极性的建立[18-19]。此外，紧密连接不仅调控上皮细胞层内外营养物质、小分子和离子的平衡，还调控细胞周期、细胞增殖及分化，抑制肿瘤细胞向恶性转化，它是细胞内外众多极性调控信号进行整合的重要平台。上皮细胞极性的丧失是上皮细胞起源癌症的一个重要特征[2]。细胞极性蛋白调控网络的异常及蛋白功能的紊乱，或者由此形成的细胞极性微环境改变等，在癌症发生、发展过程中发挥着重要作用。occludin、ZO-1是极性建立过程中发挥主要作用的极性蛋白，在多种恶性肿瘤组织中呈低表达，并与其恶性进展密切相关[3]。

TRIM1是TRIM家族的重要分子蛋白，在天然免疫应答、细胞分化、转录调节、细胞骨架重塑、发育、细胞周期和凋亡、DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。目前关于该家族分子在恶性肿瘤尤其是结肠癌中的生物学作用缺乏系统的研究。本文就TRIM1、occludin、ZO-1在结肠癌组织中的表达及临床意义进行探讨，结果发现结肠癌组织中TRIM1表达升高，occludin、ZO-1表达降低；TRIM1表达与occludin、ZO-1表达呈负相关。TRIM1、occludin、ZO-1表达与结肠癌患者临床分期、分化程度、T分期、是否淋巴结转移等有关，TRIM1高表达是影响结肠癌患者术后5年总生存的独立危险因素。关于TRIM1在结肠癌发生、发展过程中发挥的调控作用及其分子机制有待进一步研究。