反相高效液相色谱法测定穿龙骨刺片中薯蓣皂苷的含量

喻贵英 刘伟霞 罗伟 洪贇 汪杨

（太极集团重庆桐君阁药厂有限公司 重庆 401336）

穿龙骨刺片具有补肾、健骨、活血、止痛的功效。主要用于骨质增生，骨刺疼痛的治疗。该产品收载于《中国药典》2015年版一部，由穿山龙、淫羊藿、狗脊、川牛膝、熟地黄和枸杞子等6味药物组成。穿山龙为方中主药，具有祛风除湿，活血通络的功效，临床用于治疗类风湿关节炎。而薯蓣皂苷为穿山龙药材的主要指标成份。在《中国药典》2015年版一部穿龙骨刺片质量标准中采用高效液相色谱法测定穿山龙的水解产物薯蓣皂苷元的含量来控制产品质量，该方法中需要使用甲醇、三氯甲烷、乙腈，且用量较大，样品前处理时间较长。为了减少有毒有害试剂的使用，缩短检验时间，保持与穿山龙药材质量控制指标一致，便于制剂的质量控制，尽可能减少对人体及环境的影响，本文对穿龙骨刺片质量标准进行修订。

1.实验方法

1.1 仪器

安捷伦高效液相色谱仪HP-1260（自动进样器G1329B、紫外检测器G1315D），KQ-500DBB型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

穿龙骨刺片样品由桐君阁药厂提供，薯蓣皂苷（批号：111707-201402，含量以96.2%计）由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，水为二次纯化水（一级纯化水），其余为分析纯。

1.3 色谱条件

色谱柱为安捷伦Eclipse XDB-C18 250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈：水（50:50）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长203nm；进样体积：10μl 。

1.4 供试品溶液制备

取适量样品，研细，取样品0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，密塞，称定重量，超声（40kHz，500W）处理30min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.5 对照品溶液制备

精密称取薯蓣皂苷对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每ml含0.2mg的溶液，即得。

2.方法学考察

2.1 系统适应性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（50:50）为流动相；流速为1.0ml/min；检测波长为203nm；柱温：30℃。采用安捷伦C18（Eclipse XDB-C18 250mm×4.6mm，5μm）色谱柱测定，结果理论板数按薯蓣皂苷峰计算均不低于3800。

2.2 阴性对照实验

为进一步考察试验的合理性，取不含穿山龙的阴性对照样品，依正文所述方法进行测定。结果阴性样品色谱在与薯蓣皂苷峰相应的保留时间附近无干扰峰检出，从而证明本方法是合理可行的。结果见下图。

图1 薯蓣皂苷对照图

图2 阴性对照图

图3 穿龙骨刺片样品图

2.3 标准曲线制备

精密称取薯蓣皂苷对照品20.55mg（按96.2%计算含量），置25ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取贮备液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密量取上述稀释液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；依次操作，分别制成浓度为790.764μg/ml、395.382μg/ml、197.691μg/ml、98.846μg/ml、49.423μg/ml的对照品溶液，分别注入液相色谱仪，进样体积10μl。以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程为：Y=363.18X-4.3469（相关系数r=1.0）。进样量在0.49423～7.90764μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系，符合外标法定量测定的要求。

2.4 精密度试验

分别取浓度为790.764μg/ml、49.423μg/ml的对照品溶液，照正文方法，连续进样6次，每次进样10μl，记录峰面积，高、低浓度的对照品峰面积RSD均为0.3%，结果表明精密度良好。

2.5 重复性试验

取本品（批号16010001），照正文方法，独立测定6份，平均值为2.9mg/片，RSD为0.6%，结果表明重复性较好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品（批号14010001） 溶液，分别在0小时、4小时、12小时、24小时、48小时等不同时间点，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，不同时间点峰面积的RSD为0.7%，结果表明样品溶液在48小时内稳定性较好。

2.7 回收率试验

精密称取已知含量的本品细粉约0.25g（批号：16010001，每克中含薯蓣皂苷5.96mg）6份做基底，分别精密加入薯蓣皂苷对照品溶液（浓度790.764μg/ml）2ml，照正文方法进行测定，计算回收率，平均回收率为100.9%，RSD为0.6%，结果表明回收率较好。

2.8 样品测定结果

依照正文方法对10批留样品进行了含量测定，每片含薯蓣皂苷在2.4mg至3.0mg之间。考虑到药材的批间差异、生产批次间的生产偏差、药物之间的相互作用及药物的稳定性等影响因素，建议将穿龙骨刺片的含量限度制定为“每片含穿山龙以薯蓣皂苷计，每片不得少于2.0mg。

3.讨论

3.1 在穿龙骨刺片原质量标准（《中国药典》2015年版一部）中含量检测指标为薯蓣皂苷元，是通过对样品进行提取、酸水解、萃取而得的薯蓣皂苷元。从产品的工艺分析，在整个生产过程中，穿山龙药材部分取粉，部分渗漉，不存在水解。采用原方法需使用甲醇、三氯甲烷、乙腈等试剂，且用量较大，对人体及环境都有一定的影响，检验时间长，检验成本高。且穿山龙药材的质量控制指标也为薯蓣皂苷，为了便于原料与产品生产过程的质量控制，采用正文方法更适宜。

3.2 本实验通过不同取样量（0.25克、0.5克、0.7克、1.0克）、溶媒种类（70%甲醇、70 %乙醇， 50%乙醇）、超声时间（30分钟、45分钟、60分钟）、稀释倍数等因素进行考察，最后确定样品的制备选择取0.5g样品，加70%乙醇25ml超声提取30min为宜， 该方法操作简便易行。

3.3 本实验中，比较了乙腈-水（55:45、50:50）两种不同比例的流动相， 通过实验发现乙腈-水（50:50）作为流动相较好，样品分离度好，薯蓣皂苷保留时间适宜，阴性对照无干扰；并对目标色谱峰的纯度进行了检测，纯度因子符合规定。

3.4 本实验比较了安捷伦HP1200、HP1260和岛津LC-20AT等3种型号的液相色谱仪，以及安捷伦、资生堂不同厂家的色谱柱，结果表明不同厂家的仪器、C18色谱柱对薯蓣皂苷含量无显著性差异。