RP-HPLC测定硫酸羟氯喹片有关物质的方法学研究

阮圆张婷闫超王彦

1上海交通大学 （上海 200240）2上海上药中西制药有限公司 （上海 201806）

硫酸羟氯喹（HCQ）是4-氨基喹酮类抗疟药，由2个芳香环构成，氯喹中的一个乙基被一个羟乙基代替，也是一种独特的抗风湿病药物。1944年人工合成，20世纪50年代随着抗疟药在系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)治疗中的应用[1]，硫酸羟氯喹用于风湿性疾病治疗的疗效获得肯定。因其独特的作用机制和较好的安全性，硫酸羟氯喹在临床风湿病领域的应用越来越广泛。20世纪90年代以后，临床90%以上的风湿病治疗选用硫酸羟氯喹[2]。

随着对其作用机制的深入研究，硫酸羟氯喹的应用范围逐渐扩大：目前已广泛用于治疗类风湿性关节炎、盘状红斑狼疮（DLE）、系统性红斑狼疮[3]、青少年慢性关节炎，以及由阳光引发或加剧的皮肤病变；对皮肌炎、扁平苔藓、原发性干燥综合征（SS）、迟发性皮肤卟啉病（PCT）等也有一定的疗效。目前，美国药典（USP）标准和中华人民共和国国家标准及部颁标准中，羟氯喹的测定均采用薄层色谱法。经研究发现，利用薄层色谱法来检测硫酸羟氯喹的有关物质时，存在专属性不强、灵敏度低的问题，且薄层色谱法只能检出有关物质的限度，而不能测定出准确的杂质含量。英国药典（BP）虽采用高效液相色谱法（HPLC）测定，但样品制备步骤复杂。本文参考发明专利［4］，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对分析羟氯喹有关物质的方法学进行研究，样品制备步骤简便，色谱条件简单，方法准确且专属性好。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Aglient 1200，1260型全自动高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；AL 104电子天平、S 20精密pH计，梅特勒-托利多国际有限公司。

1.2 试药

硫酸羟氯喹片（批号为T140904，药用级），上海中西制药有限公司；硫酸羟氯喹工作用对照品（批号为140707，w=99.1%），甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；磷酸二氢钾（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和测定法

以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters Symmetry C8柱，150 mm×5 μm）；以甲醇-磷酸二氢钾溶液（将2.72 g磷酸二氢钾溶解在900 mL水中，加入2 mL三乙胺，用1 mol/L氢氧化钾或磷酸调节pH至8.0，再加水至1000 mL）作为流动相（梯度）；检测波长为254 nm。梯度洗脱表见表1。由表1可知，梯度洗脱时缓冲液中磷酸二氢钾与甲醇的体积比选取53∶47。在该条件下进行等度洗脱时，杂质分离不佳，运行时间过长。

表1 梯度洗脱表

测定法：取供试样品细粉适量，用稀释液（由甲醇与磷酸二氢钾溶液按体积比1∶1配制，下同）制成每1 mL中约含硫酸羟氯喹1.0 mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1 mL供试品溶液，置于100 mL容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取上述两种溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。

2.2 专属性试验

2.2.1 样品专属性试验

通过使用强光照射、高温、酸水解、碱水解和氧化的方法对供试样品进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降解途径，同时考察方法的专属性。

取供试样品细粉适量，精密称定，用稀释液制成每1 mL中含硫酸羟氯喹1.0 mg的溶液，滤过，取续滤液作为未破坏的供试品溶液。酸、碱破坏样品在稀释前加入对应量的碱或酸调节pH至中性。同法完成酸、碱空白辅料干扰试验。在上述色谱条件下，精密量取各破坏条件下的溶液20 μL，分别注入色谱仪，记录色谱图，结果见表2。

表2 有关物质-专属性试验结果

由表2可知，各破坏条件下产生的杂质的峰能与主峰有效分离，说明色谱条件专属性较强。

2.2.2 空白辅料干扰

取空白辅料适量，采用上述样品专属性试验方法，对空白辅料用强光照射、高温、酸水解、碱水解和氧化的方法进行加速破坏，经破坏的空白辅料溶液均不干扰样品中杂质的检测。

2.3 线性试验

精密称取硫酸羟氯喹工作用对照品0.025 7 g置于25 mL量瓶中，用稀释液制成每1 mL中含硫酸羟氯喹1.0 mg的线性贮备液，再分别吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL 置于 100 mL 量瓶中，加入稀释液稀释至刻度，摇匀，制成相当于对照溶液质量浓度的40%～160%的线性溶液。分别精密量取上述线性溶液各20 μL进样，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行回归，结果如表3所示。

由表3可知，在0.004 112～0.016 448 g/L范围内，硫酸羟氯喹质量浓度与峰面积线性关系良好。

2.4 精密度试验

2.4.1 重复性

取同一批号T140904（0.1 g）的供试样品，按有关物质测定法配制成供试品和对照溶液，平行测定6次并对结果进行评判。经测定，杂质质量分数分别为 0.68%，0.62%，0.62%，0.63%，0.64%，0.61%，平均总杂质质量分数为0.63%，表明方法重复性良好。

表3 硫酸羟氯喹线性回归试验结果

2.4.2 中间精密度

中间精密度考察随机变动因素对精密度的影响，主要的变动因素为测定人员、测定仪器设备、测定日期等，6次试验的平均总杂质质量分数为0.60%，与重复性试验的平均总杂质质量分数（0.63%）相比，相对标准偏差（RSD）不大于10%，表明方法中间精密度良好。

2.5 检测限与定量限

精密量取稀释液20 μL注入液相色谱仪中，记录电信号约为0.0903 mAU；精密称取硫酸羟氯喹工作用对照品适量，用稀释液稀释至质量浓度为300 ng/mL的溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪中，主成分峰与基线噪音的信噪比为9.8，10.2，10.2；用稀释液稀释成质量浓度为100 ng/mL的溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪中，主成分峰与基线噪音的信噪比为 3.2，3.6，3.6。

从以上试验可得，在本色谱条件下，硫酸羟氯喹的检测限为100 ng/mL，定量限为300 ng/mL。

2.6 溶液稳定性试验

取同一批号T140904（0.1 g）的供试样品，按有关物质测定法配制成供试品，分别于0，2，4，6，8，10，12，14，16，18 h 进样，考察主峰峰面积的日内稳定性，结果见表4。

表4 样品溶液日内稳定性试验结果

不同时间进样的主峰峰面积的RSD为0.93%，测定结果均无显著变化，表明供试样品在18 h内基本稳定。

2.7 准确度试验

精密称取硫酸羟氯喹工作用对照品（批号：140707）适量，按处方量加入空白辅料，设计3个不同质量浓度（分别为80%、100%、120%）,制成每1 mL含硫酸羟氯喹0.01 mg的混合溶液。每个质量浓度分别配制3个供试品溶液，按色谱条件进行回收率测定，结果见表5。实验结果显示平均回收率为99.52%，RSD为1.03%，表明准确度较好。

表5 硫酸羟氯喹有关物质测定准确度试验结果

2.8 耐用性试验

使用色谱柱Waters Symmetry C8（150 mm×5 μm）将色谱条件中的参数作适度变化（如对流速、柱温等参数作微小调整），对测定结果进行比较，数据见表6。

对柱温在20～30℃，流速在0.8～1.2 mL/min之间变化进行耐用性考察，结果显示柱温和流速对主成分及杂质的保留时间有影响，但是对相对保留时间没有影响，表明本方法耐用性良好。

3 结果与讨论

（1）取甲醇与磷酸二氢钾溶液体积比为47∶53的缓冲液作为流动相进行梯度洗脱，不仅可提高分离度，也可缩短试验时间。

（2）硫酸羟氯喹在0.004 112～0.016 448 g/L质量浓度范围内线性良好，回归方程为：y=365 33x-3.56,R=0.999 5，检测限为100 ng/mL，定量限为300 ng/mL。

本RP-HPLC法色谱条件简单，检测快速、准确、专属性强，可用于羟氯喹有关物质的测定。

表6 T140904（0.1 g）耐用性试验结果