威宁紫苏原花青素提取及抗氧化活性

闫莉莉，禄 露，鲁连芳



威宁紫苏原花青素提取及抗氧化活性

闫莉莉，禄 露，鲁连芳

（铜仁学院 材料与化学工程学院，贵州 铜仁 554300 ）

基于单因素实验和正交实验，获得了威宁紫苏叶片原花青素的最佳提取工艺，主要参数为：乙醇浓度85%、料液比1:25、微波功率（300 W）、微波时间30 s，该工艺条件下原花青素的粗得率为6.4 mg/g，纯化制品得率为0.64%，样品纯度为86.54%。当所提取的原花青素浓度为0.008 mg/mL时，对羟基自由基清除率可达54.21%，对Fe3+的总还原能力最强。说明紫苏原花青素具有一定的抗氧化活性。

紫苏； 原花青素； 抗氧化活性

0． 引言

紫苏（）为唇形科一年生草本植物[1]，主要分布于我国江苏、云南和贵州等20多个省市。威宁县地处海拔2200米，气候环境适宜紫苏生长，紫苏资源丰富。紫苏为药食同源植物，其叶富含氨基酸、原花青素、紫苏宁和矢车菊素3,5-二葡糖苷等特有的活性物质和营养成分[2-3]。近年来，关于紫苏中紫苏籽油[1]、花色素苷[4]、咖啡酸[5]、黄酮类及微量元素[6]等活性成分研究较多，而对其中原花青素的提取及抗氧化活性的相关报道较少。

原花青素（Oligomeric proanthoyanidins, OPC），是一种富含双黄酮衍生物的天然多酚化合物，具有很强的抗氧化和清除自由基活性[7]，可广泛应用于护肝解毒[8]、消炎抗癌[9-10]、降血压[11]、治疗心血管[12]等疾病。目前市售的原花青素产品多来源于黑枸杞[13]、葡萄籽[14]、黑莓[15]和紫薯[16]提取物，而紫苏提取物的原花青素产品较少。

为充分利用贵州威宁县当地资源，对紫苏叶原花青素的提取工艺和抗氧化活性进行研究，为原花青素资源的开发提供参考。

1．材料与方法

1．1．材料与试剂

新鲜紫苏叶片采自于贵州省威宁县。

主要试剂有：原花青素标准品（UV≥95%，20 mg/支，购于国家标准物质网）；甲醇、无水乙醇、石油醚、丙酮、水杨酸、硫酸亚铁、双氧水、三氯化铁、三氯乙酸、铁氰化钾均为分析纯；0.05 mol·L-1磷酸缓冲液由0.05 mol·L-1Na2HPO4溶液和0.05 mol·L-1K2HPO4溶液组成，使用前按一定比例混合，并调节好pH值；实验用水为超纯水。

1．2．主要仪器

T6新世纪型紫外-可见分光光度计（北京普析通用有限公司）；MM823EC8-PS（X）型微波炉（广东美的集团有限公司）；KA-1000型低速台式离心机（800～4000 rmp，杭州艾普仪器设备有限公司）。

1．3 方法

1．3．1．原花青素的提取

取自然晾干的紫苏叶，用粉碎机粉碎，称取紫苏干粉2.00 g，加入一定量80%乙醇溶液，在一定微波功率下加热处理1 min，然后在4000 r/min条件下离心5 min，上清液用石油醚萃取除去叶绿素等杂质，部分待测样品用热稀酸处理，得到酒红色的原花青素离子。

1．3．2．最佳提取条件的确定

保持其他条件不变，分别考察浸提剂浓度、料液比、微波时间、微波功率对原花青素提取得率的影响，并用正交试验确定各因素最佳值。

1．3．3．紫苏叶原花青素的纯化

对1.3.2中最佳工艺所得原花青素，采用结晶纯化法[17]。原花青素提取液置于60%的甲醇中，并于室温浸泡6 h，以60～70 ℃水浴加热15 min，将提取液减压浓缩，待液体浓缩成浆糊状时停止操作，再用乙醇和乙醚洗涤浓缩物，用温水溶解不溶部分，过滤以后加入等体积的乙醇于冰箱静置5 h，再一次过滤将杂质除去，将滤液在30～40 ℃条件下减压蒸干，取残渣并溶于冷蒸馏水，向容器中加入2倍的乙醇，放置冰箱静置12 h，待容器底析出棕色晶体，为进一步提纯，再次将其溶解于60 ℃的50%乙醇中，过滤后将滤液在30～40 ℃下减压浓缩，在冰箱静置12 h，结晶分离后，即得棕色原花青素。

1．3．4．原花青素的含量测定

以原花青素标准品配制一系列标准溶液，绘制标准曲线，同等条件下，测定原花青素提取液的吸光度，然后根据标准曲线计算紫苏原花青素的浓度，按公式（1）换算出原花青素的得率，并按公式（2）计算纯度。

式中，c为原花青素浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；M为原料质量，mg。

本研究根据垃圾填埋场的特点，建立了沼气产气模型，并进行了相应沼气发电机组的设计；根据沼气机组的余热特点，提出了利用余热进行发电的方案。利用沼气发电机组发电，不仅解决了沼气的去处问题，还通过发电产生了一定的效益。利用机组余热，通过ORC循环进行发电，进一步提高了沼气发电的效率，具有节能环保高效的特点。

式中，m1为产物中原花青素的质量，mg；m0为产物质量，mg。

1．3．5．紫苏叶原花青素·OH清除率的测定

采用Fenton法进行测定。在25 mL反应体系中，依次加入3 mL 7.5 mmol/L FeSO4、1%H2O2溶液，摇匀后再加3 mL 6 mmol/L水杨酸，摇匀并于37 ℃水浴中加热15 min，在波长为510 nm处测其吸光度A0。然后分别加入一定量不同浓度的待测液，继续水浴加热15 min，取出测其吸光度Ax，并按（3）式计算·OH的清除率。

式中，A0为未加待测样品吸光值，Ax为加待测样品的吸光值。

1．3．6．紫苏叶原花青素总还原能力的测定

分别取浓度为0.002、0.003、0.004、0.005 L、0.006、0.007、0.008 mg/ mL的原花青素试样1 mL，分别依次加入pH=6.6的磷酸缓冲液2.5 mL和1%铁氰化钾（K3Fe(CN)6）溶液2.5 mL，待混合均匀后于50℃水浴20 min，再加入质量分数为10%三氯乙酸溶液2.5 mL混合，取混合液2.5 mL，再加入质量分数为0.1%氯化铁2.5 mL和蒸馏水2.5 mL，混合静置10 min，在波长为700 nm处测其吸光度。

2．结果与分析

2．1．原花青素标准曲线的制作

y=2.3761x+0.012 (R2=0.9985) （4）

2．2．单因素实验

2．2．1．乙醇浓度的影响

在浸提时间为35 s、微波功率为440 W、料液比为1:20、提取1次的条件下，不同乙醇浓度对紫苏原花青素得率的影响如图2所示。随着乙醇的浓度增加，得率逐渐增加，但当乙醇浓度达到80%时，如果再增加浓度，原花青素的得率会下降，因此，最佳浸提浓度应在80%左右。

图2 浓度乙醇对原花青素提取的影响

图3 料液比对原花青素提取的影响

图4 微波时间对原花青素提取的影响

2．2．2．料液比的影响

在乙醇浓度为80%、提取时间为35 s、微波功率440 W、提取1次的条件下，不同料液比对紫苏中原花青素浸提效果如图3所示。可知，随着料液比的不断增加，得率呈逐渐降低的趋势，当料液比增加到1:20时，得率相对最高。

2．2．3．提取时间的影响

在乙醇浓度80%、微波功率440 W、料液比为1:20、提取1次的条件下，微波时间对紫苏原花青素得率的影响如图4所示。可知，随着微波时间的加长，得率不断增加，当微波时间超过35 s时，乙醇挥发较多，得率降低。

2．2．4．微波功率的影响

在乙醇浓度80%、微波时间为30 s、料液比为1:20、提取1次的条件下，微波功率对紫苏花青素得率的影响如图5所示。可知，随着微波功率的增加，得率不断增加，当微波功率大于440 W时，原花青素得率下降。

图5 微波功率对原花青素提取的影响

2．3．正交实验结果

在单因素实验基础上，采用四因素三水平的正交试验对微波时间，微波功率，乙醇浓度，料液比四个因素进行优化，每组实验做三次平行实验。因素水平如表1所示。

表1 正交实验设计因素与水平

Tab.1 factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交实验结果

正交实验结果如表2所示。可看出A因数的极差最大，故影响紫苏中原花青素的得率最大因素为微波功率，其次是乙醇浓度、料液比，影响最小的因素为微波时间，根据K值的大小可知，紫苏原花青素提取的最优条件为A2B1C3D3，即微波功率为300W，微波时间为30 s，乙醇浓度为85%，料液比为1:25。此条件下原花青素的粗得率为6.4 mg/g。

2．4．原花青素的纯化及含量测定

采用1.3.3和1.3.4方法对原花青素进行纯化并计算含量，原花青素的粗得率为6.4 mg/g，纯化后得率为0.64%，样品纯度为86.54%。

2．5．抗氧化活性分析

原花青素浓度与羟基清除率之间的关系如图6所示。由图可知，随着原花青素浓度不断增加，清除率逐渐增大，当原花青素浓度达到0.008 mg/ mL时，清除率可达到54.21%。

2．6．总还原能力分析

原花青素的总还原能力如图7所示。由图可以看出，在实验浓度范围内，原花青素对Fe3+的总还原能力与其浓度成正比，当浓度为0.008 mg/ mL时还原能力最强。

3．结论

通过单因素实验，并在正交试验的基础上，得出在提取时间为30 s、微波功率为300 W、乙醇浓度为85%、料液比为1:25的条件下可达最佳提取效果，得到原花青素的浸提取量为6.4 mg/g。通过结晶法纯化的原花青素得率为0.64%，纯度为86.54%，且具有较强的清除羟基自由基能力和还原能力。

图6 原花青素对Fenton体系产生·OH的清除作用

图7 原花青素总还原能力

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Extraction and Antioxidation Properties of Oligomeric Proanthoyanidins fromin Weining County

YAN Lili, LU Lu, LU Lianfang

( College of Material and Chemical Engineering, Tongren University, Tongren 554300, Guizhou, China )

Based on single factors and orthogonal experiments, the optimum extraction conditions of oligomeric proanthoyanidins fromleaves in Weining county was obtained: ethanol concentration 85%, solid-liquid ratio 1:25, microwave power 300 W, microwave time 30 s. The crude yield of oligomeric proanthoyanidins was 6.4 mg/g. The yield of purified products was 0.64%, and the purity of samples was 86.54%. The scavenging rate of hydroxyl radical reached 54.21%, and the total reduction ability of Fe3+was the strongest at the concentration of oligomeric proanthoyanidins 0.008 mg/mL.It shows that perilla seed anthocyanin has certain antioxidant activity.

, oligomeric proanthoyanidins, antioxidant activity

R284.2

A

1673-9639 (2018) 09-0001-05

2018-03-30

贵州省普通高等学校产学研基地（黔教合KY 字[2015]346）；贵州省教育厅大学生创新创业训练中心项目 （2016SJDCZX001）；2017 年第二批产学合作协同育人项目（201702108094）。

闫莉莉（1984-），女，河南周口人，硕士，讲师，研究方向：电分析化学与抗氧化，E-mail: yanli0919@126.com.

（责任编辑 杨凯旭）（责任校对 谢 勇）