外泌体及其在运动干预代谢性疾病中的调控作用研究进展

李高华 叶啟发杨翼

1武汉体育学院研究生院（湖北武汉430079）

2河南农业大学体育学院

3武汉大学中南医院

4武汉体育学院健康科学学院

为了通讯和组织稳态的需要，细胞在静息状态或不同的刺激下均会分泌胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。EVs存在于所有的体液中，其出现与特殊的生理和病理状态相关[1]。EVs主要分为外泌体（exosomes，EXs）和微囊泡（microvesicles，MVs），当前研究最多的是EXs。已证实EXs含有多种参与生理和病理过程的多肽、miRNA、mRNA和线粒体DNA，借助于它们在细胞和组织之间实现通讯交流[2]。运动带来的系统性益处可能是通过EXs以自分泌、旁分泌和/或内分泌方式进行调节的，在对运动的应答中，循环中EXs的内含物可以强度依赖性方式增加[3]，从而在代谢性疾病的防治中发挥作用。

1 EXs的来源及其生物学特性

1.1 EXs的来源

外泌体（exosomes，EXs）最初用来定义不同培养细胞所分泌的直径范围在40～1000 nm的囊泡[4]，后来这个命名被网织红细胞分化过程中由多囊体与细胞膜融合后释放的直径40～100 nm的胞外囊泡（EVs）所采用。研究证实多种细胞（B淋巴细胞、树突状细胞、细胞毒性T细胞等）在正常生理及病理状态下均可通过相似的途径分泌EXs[5-8]，此外，EXs已成功从不同体液中提取出来，包括血浆、血清、唾液、羊水、乳汁、尿液、腹水和脑脊液[9-11]。

1.2 EXs的生物合成和分泌

在早期核内体向晚期核内体发育成熟过程中，晚期核内体界膜内陷出芽形成管腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）[12]。这些ILVs转变为亚细胞结构的多囊体（multi-vesicle bodies，MVBs）并与质膜融合，释放EXs到胞外环境中[13]。多囊体里面EXs的形成很大程度上依赖于保守的ESCRT蛋白，它由4种可溶性多蛋白复合体组成（ESCRT-0、-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ）[9，14]。泛素化蛋白与凋亡连接基因2相互作用蛋白X（apoptosislinked gene-2-interacting protein X，ALIX）、肿瘤易感基因 101（tumor susceptibility gene101，TSG101）及ESCRT-Ⅰ复合物结合，激活了ESCRT-Ⅱ，随后导致低聚化和ESCRT-Ⅲ复合物的形成[14]。该复合物参与了运载蛋白的导入和分拣，并进入腔内囊泡，最终成为EXs。EXs分泌以结构性和调节性方式进行，在对胞外信号如ATP、神经递质、去极化、凝血酶受体激活、脂多糖等的反应中通过Ca2+信号或细胞应激来控制[15-17]，最终分泌到胞外环境中。

1.3 EXs分子组成和生物学特性

Exs含有的特异性蛋白成分包括：ALIX、TSG101、网格蛋白（clathrin）、整合蛋白（integrins）、跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81和CD82）以及转运和融合蛋白：脂筏标记蛋白（flotillin）、鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）、膜联蛋白（annexins）；EXs中的脂质成分包括：ALIX相互作用的溶血磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、神经酰胺、鞘脂类和磷脂酰甘油[18]。此外，EXs还携带多种特异性分子，包括mRNA、miRNA、少量的DNA、转录因子、细胞因子、生长因子等[19]。

EXs分泌到胞外环境中可以导致受体细胞生理或病理过程发生改变。除此之外，它们还带有与其来源细胞相关的生物分子，这有助于它们的识别，通过与受体相互作用激发信号级联反应，与特异性靶细胞相互作用并参与细胞间的通讯[20]。

2 EXs的作用机制和功能

2.1 EXs的作用机制

许多疾病的进程都有EXs的参与，但EXs对受体细胞的作用机制还不太清楚。近年来，EXs信号通路和作用机制被广泛研究，尤其是在与之相关的各种病理作用和生物标志物方面[13，21，22]。EXs可以通过以下3种途径发挥生物学作用（图1）：（1）通过表面相关分子参与抗原递呈或通过受体细胞膜上的受体活化参与信号传导；（2）通过特异性受体与受体细胞膜绑定，受体细胞通过内吞作用将EXs内化；（3）EXs与受体细胞直接融合并将内含物释放入受体细胞胞质。

图1 Exs作用于受体细胞发挥生物学作用的三种方式（引自Mirja Krause[23]，略有改动。）

2.2 EXs的功能

最早认为EXs是细胞排泄废物的一种方式[24]，随着对其生物来源、物质构成及运输、细胞间的信号传导以及在体液中分布的大量研究发现，EXs具有多种多样的功能。大量研究主要集中于对多种疾病的诊断、疫苗的开发、抗肿瘤和抗炎症的临床治疗等方面。比如EXs能够参与抗原递呈激活抗肿瘤免疫反应[25]，肿瘤细胞分泌的EXs通过血管生成和肿瘤细胞迁移促进肿瘤的发展[26]；树突状细胞和肠上皮来源EXs对巨噬细胞功能具有促进作用[27，28]；支气管肺泡液中的EXs与呼吸道上皮细胞促炎症细胞因子分泌相关[29，30]。此外，心肌内注射来源于低氧暴露12小时的心肌祖细胞的EXs可以改善心脏功能，并降低心肌纤维化[31]。

3 EXs在代谢性疾病中的作用

3.1 EXs可作为代谢性疾病的诊断标志物

研究表明，在肥胖以及相关的胰岛素抵抗、糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病中，循环EXs水平均出现升高[32，33]，并且代谢综合症、2型糖尿病、高胆固醇血症和高血压患者具有不同的EXs miRNA特征[34]。脂肪细胞来源的EXs与脂代谢、肥胖相关的胰岛素抵抗相关[35]。肥胖大鼠和人的脂肪细胞分泌EXs的数量与其对依赖脂肪酸氧化的细胞迁移作用是一致的[36]。与皮下脂肪干细胞相比，肥胖者腹腔大网膜脂肪干细胞来源的EXs及其包裹的长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）浓度升高[37]。值得注意的是，这些患者进行能量限制或肥胖手术后EXs的水平出现了显著性下降[38]。

由此可以看出，EXs水平与代谢性疾病相关。EXs的成分反映了其来源细胞的功能状态，甚至包含病态细胞的相关分子信息[39]，不同疾病的细胞都能分泌含有特定RNAs的EXs[40]。因此检测体液中的EXs，对其进行RNA组成分析，有助于代谢性疾病的临床诊断和预后判断。

3.2 EXs在代谢性疾病中发挥作用的相关机制

在代谢性疾病中，EXs能够转运功能性mRNA、miRNA、细胞因子和生长因子，激活靶细胞的下游信号通路，影响该疾病的发生和发展。

在代谢性疾病中研究最多的是脂肪细胞来源的EXs。肥胖者内脏脂肪细胞来源的EXs携带miRNA（miR-23b、miR-148b、miR-4269、miR-4429）可定向调节转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和经典的Wnt信号通路（wnt/β-catenin），在脂肪分布、脂肪细胞分化、终末器官炎症和纤维化信号中起作用[41]。这些EXs进入肝细胞诱导TGF-β信号转导途径调节异常可能是非酒精性脂肪肝的发病机制[42]。而且脂肪细胞分泌的EXs能够被外周血单核细胞摄取并分化成活化的巨噬细胞，进一步促进TNF-α（tumour-necrosis factor-α）和IL-6的分泌，调节肥胖和胰岛素抵抗。在体外实验中，脂肪细胞来源外泌体对代谢性疾病的作用也得到了证明。如注射肥胖小鼠脂肪细胞来源的EXs能够引起正常小鼠的胰岛素抵抗，其可能的机制是EXs介导了巨噬细胞活化，削弱了肌细胞对胰岛素的反应和对葡萄糖的摄取[43]；也有研究认为这种EXs携带的miR33a和miR-374b介导了脂肪组织和巨噬细胞之间的通讯，并降低了巨噬细胞胆固醇逆向转运基因的表达，最终引起肥胖相关的动脉粥样硬化[44]。

此外，学者对胰岛素抵抗和糖尿病大鼠来源的EXs进行了代谢性疾病的相关机制研究。高脂喂养诱导的胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠分泌的EXs，能够诱导体外实验中大鼠心脏血管内皮细胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的表达和活性氧类（reactive oxygen species，ROS）的产生，二者都是糖尿病内皮功能障碍的主要信号中介[45]。Jalabert等[46]用同样高脂饲料诱导的糖尿病鼠模型发现，肌肉来源的EXs能在肌肉细胞之间转移软脂酸和油酸，在胰岛素抵抗发生中转移信号物质到胰腺β细胞，并且证明了EXs在胰岛素抵抗过程中有助于β细胞的适应。为了对比健康个体EXs的良性作用，Jansen等[47]证明来源于健康大鼠血管内皮细胞的EXs能通过转运miR-126修复受损的内皮组织，来源于心肌细胞的EXs则具有促血管生成，刺激内皮细胞增殖、迁移以及管腔形成的作用。而糖尿病大鼠来源的EXs具有相反的作用，其原因可能是心肌细胞EXs miR320被转移到内皮细胞，从而下调IGF-1、HSP20以及Ets-2的表达，导致内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的抑制。因此该研究提出了一个可能的新机制，即糖尿病心肌血管生成损伤可能是由心肌细胞分泌的抗血管生成的EXs引起的[48，49]。

在体外实验研究中，EXs通过干扰素-γ激活信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）、脂质激活Notch信号通路等，从而从不同途径影响代谢性疾病的发生发展[50，51]。

总之，这些前期的研究结果从不同角度阐释了EXs在代谢性疾病中的作用机制，可能通过EXs携带的miRNA或蛋白成分介导了代谢性疾病发生发展中的信号通路，为进一步通过EXs进行代谢性疾病的治疗奠定了基础。

4 运动介导的EXs在代谢性疾病中的调控作用

运动是代谢性疾病非药物治疗的首选方法，尤其是耐力运动，能改善肥胖和糖尿病人群的血糖控制和胰岛素敏感性[52]。虽然运动促代谢的多系统效应已被证实，但是运动对改善代谢性疾病的潜在分子机制还未完全阐明。有学者提出积极调节代谢性疾病的运动因子exerkines（即由于对运动的应激而释放到循环中以促进器官间信息通讯并增强全身系统性益处的肽类和miRNAs等分子物质）存在于EXs中，那么将来相关疾病的治疗可能涉及到富含exerkines的EXs的修饰或改变[53]。

EXs的分泌受体内外环境的影响而改变[20]。体外实验表明，受到缺氧刺激后细胞分泌EXs的成分发生改变[54]，进而促进损伤组织的修复。体内实验则证实，心肌组织缺氧后分泌的EXs改变了miRNA成分，调节miRNA可以起到有益的作用[31]。缺氧是大强度运动对机体造成的良性刺激，运动中EXs的释放是否具有类似潜在的益处值得运动医学领域学者的深入研究。

4.1 EXs是Exerkines的良好载体

细胞外环境不是Exerkines存在的适宜环境，由于EXs独特的包装保护作用，使这些exerkines免受核糖核酸酶的影响[14]，故通过EXs转运这些物质成为可能[2]。最近研究表明，miRNAs能够被EXs吸收并分泌到循环中或者从循环中摄入细胞，以受体依赖和非依赖的方式影响受体细胞，可促进多肽、miRNA、mRNA和线粒体DNA在细胞和组织之间交流，把信息传递给其他细胞[2]。运动导致富含miRNAs的EXs从运动的骨骼肌释放到循环、血管或脂肪组织，促进器官间的信息通讯，并控制基因的表达[55]。研究进一步揭示了EXs携带的特异性 miRNAs，如 miR-1、miR-2、miR-133、miR-182和miR206通过靶向肌细胞并改变基因表达来参与肌细胞的生理和病理状态调节[56]。这为EXs成为exerkines的良好载体提供了确凿证据。

4.2 运动中EXs的分泌及其作用

规律性运动能使肌肉代谢和心血管系统产生适应，影响机体长期的动态平衡过程。EXs作为信号媒介，介导了局部或远距离的适应性反应，在生理或病理方面产生了广泛的影响[9，57]。骨骼肌不仅是人体最重要的运动器官，也是活跃的内分泌器官，肌肉因子（myokines）不仅可以作用于骨骼肌本身，还可通过血液循环到达外周，作用于肝脏、脂肪、心脏等器官，调节机体代谢[58]。通过对骨骼肌分泌的因子进行蛋白组学分析，确认437种蛋白有65.3%存在于EXs中[59]。证据显示，由骨骼肌分泌的myokines（IL-4、IGF-1、irisin等）和脂肪组织产生和分泌的肽类物质（leptin、adiponectin、TNF-α等）在运动干预糖尿病、血脂异常和肥胖等机制中参与了相关信号通路的调节[58，60-64]。因此，运动介导的EXs可能成为治疗代谢性疾病的潜在靶点。

当前有关运动和EXs的研究较少，主要集中在不同运动类型和强度对血浆EXs的影响。Fruhbeis等[1]研究了一次性运动对EXs分泌的影响，结果表明，与安静状态对比，运动可促使EXs快速释放到循环当中。据此推测，在运动介导的身体适应过程中，EXs的释放可能参与了细胞通讯，并影响了组织和器官间的信号交互作用。该研究还发现，EXs分泌受运动类型的影响，相比于自行车而言，跑台运动引起的EXs释放更持久，这可能与机体参与跑台运动的肌肉更多有关。此外，EXs在无氧阈出现之前已经释放，似乎没有受到乳酸积累和血液酸化的影响，说明诱导EXs释放的潜在因素很可能在运动的有氧期间已开始起作用[1]。Safdar等[2]用免疫组织化学方法，发现在一次性耐力运动后骨骼肌中ALIX显著减少，表明EXs分泌到了循环系统中。结合另外一项研究结论——骨骼肌来源的EXs进入其他外周组织，并直接调节糖的摄取和代谢平衡[65]，可以推测耐力运动对代谢性疾病的调控作用可能是通过骨骼肌分泌的EXs介导的。

Barone等[66]对单次运动引起的EXs释放进行了更为深入的研究，发现运动介导的EXs通过携带HSP60进入血液激活PGC1α1，进而使线粒体增加并调节细胞的能量代谢，从而有利于肌肉功能的提高，并与代谢性疾病的发病机制相关[67]，推测存在于胞外和血液中的EXs可能参与了细胞间通讯，介导了运动对代谢性疾病的有益调节。

在剧烈或中等强度运动时，运动后出现血小板和内皮细胞来源的EXs增加[68-70]，运动导致的血液对血管内皮细胞的剪切力刺激内皮细胞分泌EXs并转移到平滑肌细胞，从而介导了抗动脉粥样硬化的功能[71]。Chaturvedi等[63]以2型糖尿病小鼠为模型进行为期8周的有氧运动后发现，心脏分泌的EXs含有较高的miR-455和miR-29b，它们结合在基质金属蛋白酶9基因（matrix metalloprotein-9，MMP9）的3’非翻译区域下调其表达。而MMP9的降低参与了胞外基质代谢并阻止了心肌纤维化和心肌细胞解偶联，因此可能参与了运动改善糖尿病心血管并发症的血脂异常和高胰岛素血症。Lancaster等[72]从运动与热休克蛋白72（HSP72）的释放方面进行综述，指出EXs是运动诱导的HSP72的释放媒介，对增强免疫、维持细胞稳态和保护细胞免于各种应激起作用。细胞中HSP72的高表达可抑制应激活化蛋白激酶（JNK）信号转导[73]，而JNK通过影响胰岛素受体底物-1（IRS-1）丝氨酸307磷酸化，减弱IRS-1磷酸化造成胰岛素敏感性降低[74]。这为运动诱导EXs通过HSP72治疗糖尿病提供了可能的证据。

肖俊杰等[75]的研究表明，3周游泳运动诱导的EVs的增加（增加1.85倍）增强了小鼠内源性EVs对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。更有意义的是，提取运动干预小鼠的血清EXs，通过心肌内注射到再灌注损伤小鼠，同样表现出类似的心肌保护作用。其中的信号通路可能是运动诱导的EVs通过激活ERK1/2和HSP27磷酸化介导了过氧化氢处理的H9C心肌细胞的抗凋亡，从而对心肌损伤产生保护效应。

综上所述，当前有关运动和EXs的研究文献虽然较少，但是已经为EXs在运动医学领域的研究揭开了新的篇章。这些研究涉及运动强度、运动方式、运动类型以及运动时间与EXs分泌的量效关系，并从相关蛋白信号和miRNAs方面探讨了EXs对代谢性疾病的潜在作用机制。虽然结果不尽一致，但可以肯定的是，运动是促进EXs大量释放的重要因素。在运动过程中，机体生理状态的激活引起急性应激，这种应激反应促进了EXs的释放。将来的研究需要关注长期运动、抗阻运动对EXs的影响及其对代谢性疾病的作用机制，并借助于分子生物学、蛋白组学、基因组学和脂类组学等技术研究运动过程中EXs释放的细胞来源、分子组成、作用靶标以及介导代谢性疾病的信号通路，为运动介导的EXs在代谢性疾病中的作用提供强有力的证据。

5 小结

由于EXs具备作为疾病诊断标志物和药物载体的潜力，近年来引起了医学界的极大关注。而运动作为机体的一种良性刺激势必与EXs分泌相联系。假设运动防治代谢相关疾病是由EXs释放其中的运动因子来介导的，那么运动—EXs—代谢性疾病之间就可以建立密切联系。随着研究的深入，运动与EXs之间的量效关系及其在代谢性疾病中的作用机制将为代谢性疾病的运动干预防治机理研究提供新的视角。