一次及多重脑震荡大鼠伤后1、3、6月空间认知变化动态观察

王家雄 王路宋海，2 郑永江张睿张桓杨力郭泽云于建云

1昆明医科大学法医学院（昆明650500）

2昆明医科大学附一院神经外科

3昆明医科大学组织胚胎学教研室4红河州第一人民医院

脑震荡（cerebral concussion）一直被认为是创伤性脑损伤中最轻的类型，患者表现为一过性意识丧失和逆行型遗忘，预后良好，绝大多数患者脑功能经过一定时间后可恢复正常。但近些年临床观察与流行病学研究发现，短期内遭受多次轻微创伤的重复性脑震荡（multiple cerebral concussion，MCC）患者，易出现远期学习记忆功能与情感障碍等问题，最终发展为痴呆的慢性创伤性脑病（chronic traumatic encephalopathy，CTE）[1]。临床观察发现，MCC患者常有以下病程特征，以伤后3个月为急性期，患者有头痛、视物模糊、健忘、耳鸣和疲劳等急性期症状，大多在数天或几周恢复；如果急性期症状持续超过3个月，并出现认知与情感行为方面的问题时被称为脑震荡后综合征（post concussive syndrome，PCS）；如果PCS症状持续超过1年以上者，则为CTE，轻型脑损伤远期并发症主要表现为认知改变、情感异常、抑郁和自杀、运动功能受损与痴呆等[1，2]。本课题组于建云等[3-5]先前虽对多次性脑震荡大鼠学习认知行为的早期变化进行过研究，但对一次与多次性脑震荡伤后远期的认知行为动态变化比较研究至今未见有报道，故特设计本实验研究。

1 材料方法

1.1 动物分组及模型复制

7周龄SD雄性大鼠180只，购自斯XX达有限公司，体重280±30 g。动物编号后随机分为实验对照组（control，C）和脑震荡组，脑震荡组完成第一次打击后随机分为单纯脑震荡（pure cerebral concussion，PCC）组和多重脑震荡（multiple cerebral concussion，MCC）组，多重损伤组完成第2次打击后再随机分为二重脑震荡组（2MCC）和三重脑震荡组（3MCC），各组又分为3个亚组分别在伤后1月、3月、6月进行观察。模型复制参照于建云等[3-4，6]的方法，将每次打击符合轻型脑损伤判断标准的大鼠纳入研究，多重脑震荡每次打击的间隔时间为24小时（MCC24h），排除模型复制过程中判断为重型脑损伤、死亡以及伤后饲养过程中死亡的大鼠，所有老鼠在相同条件下饲养。

1.2 行为学实验

在观测时间点前，连续7天进行Morris水迷宫测试（MWM），以评估大鼠空间学习记忆功能。即1月组在伤后23天开始，3月组在伤后83天开始，6月组在伤后173天开始。水迷宫实验含以下3个步骤：（1）第1～5天水下隐匿平台实验：随机按4个方向将大鼠放入迷宫，记录大鼠找到平台所需要的时间（逃避潜伏期），超过120 s未找到则人为将大鼠放到平台上并记为120 s，让大鼠在平台上停留30 s后离开迷宫休息4 min，随后又开始另一轮实验，直到4个方向都测试完毕。该测试连续进行5天。（2）第6～7天水上可见平台实验：将实验平台升高4 cm暴露于水面上，按水下平台实验步骤进行，该实验进行2 d。（3）第7天无平台探测实验：于第7天水上平台实验完成并休息 4 min后立即进行。将平台移出迷宫，大鼠从远离平台象限的方向放入迷宫，测试 2次；记录大鼠在原有平台象限的停留时间，每次实验时间为60 s。两次实验间期休息4 min[4]。

1.3 数据分析

用SPSS 17统计软件对数据进行处理，所有结果用均数±标准差（±s）表示，统计方法采用单因素方差分析。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 伤后 1月水迷宫实验结果（表1）

水下平台逃避潜伏期：实验组与对照组比较以及各实验组之间比较，1～5天均没有统计学差异（P＞0.05）。

水上平台逃避潜伏期：与对照组比较，PCC组没有统计学差异（P＞0.05），2MCC组于第7天、3MCC组于第6、7天有显著统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）；与PCC组比较，2MCC组于第7天、3MCC组于第6、7天有显著统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）；2MCC组与3MCC组比较于第7天有统计学差异（P＜0.05）。

无平台探测实验：各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 不同脑损伤后1月水迷宫实验结果（s）

2.2 伤后 3月水迷宫实验结果（表2）

水下平台逃避潜伏期：与对照组比较，PCC组没有统计学差异（P＞0.05），2MCC组于第5天，3MCC组于第4、5天延迟有显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。各实验组之间比较无统计学差异（P＞0.05）。

水上平台逃避潜伏期：与对照组比较，PCC组没有统计学差异（P＞0.05），2MCC组和3MCC组有显著统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）；与PCC组比较，仅3MCC组第 6、7天有显著统计学差异（P＜0.01）；2MCC组与3MCC组比较没有统计学差异（P＞0.05）。

无平台探测实验：与对照组比较，PCC组没有统计学差异（P＞0.05），2MCC组和3MCC组停留时间缩短具有显著统计学意义（P＜0.01）。与PCC组比较仅3MCC组具有显著统计学意义（P＜0.01）。2MCC组与3MCC组比较没有统计学差异（P＞0.05）。

表2 不同脑损伤后3月水迷宫实验结果（s）

2.3 伤后 6月水迷宫实验结果（表3）

水下平台逃避潜伏期：与对照组比较，PCC组没有统计学差异（P＞0.05），2MCC组于第5天，3MCC组于第2、3、4、5天延迟有统计学或显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与PCC组比较，2MCC组没有统计学差异（P＞0.05），3MCC组于第4、5天延迟具有统计学意义或显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。2MCC组与3MCC组比较没有统计学差异（P＞0.05）。

水上平台逃避潜伏期：与对照组比较，PCC组、2MCC和3MCC组于第6、7天有统计学或显著统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）；与 PCC组比较，2MCC组和3MCC组于第6、7天有统计学或显著统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）；2MCC组与3MCC组比较于第7天有显著统计学差异（P＜0.01）。

无平台探测实验：与对照组比较，PCC组、2MCC组和3MCC组在原平台象限停留时间缩短均有统计学或显著统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）。与PCC组比较，2MCC和3MCC组均具有显著统计学意义（P＜0.01）。2MCC组与3MCC组比较没有统计学差异（P＞0.05）。

表3 不同脑损伤后6月水迷宫实验结果（s）

2.4 各损伤组伤后 1、 3、 6月动态变化

PCC组：与对照组比较，伤后1、3月均没有统计学意义（P＞0.05），伤后6月水上平台实验逃避潜伏期延迟和在原平台象限停留时间缩短有统计学差异（P＜0.05）。

2MCC组：与对照组比较，水下平台实验逃避潜伏期延迟，伤后3、6月的第5天有统计学或显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；水上平台实验逃避潜伏期延迟，伤后1、3、6月的第6、7天均有统计学或显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；无平台探测在原平台象限停留时间缩短，伤后3、6月均有显著统计学意义（P＜0.01）。与PCC组比较，伤后6月的水上平台实验和无平台探测实验差异均有统计学或显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

3MCC组：与对照组比较，水下平台实验逃避潜伏期延迟，伤后3月的4、5天以及6月的2、3、4、5天有统计学或显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；水上平台实验逃避潜伏期延迟，伤后1、3、6月均有显著统计学意义（P＜0.01）；无平台探测在原平台象限停留时间缩短，伤后第3、6月均有显著统计学意义（P＜0.01）。与PCC组比较，伤后第1、3、6月水上平台，6月水下平台以及3、6月无平台探测实验差异均有统计学或显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与2MCC比较，伤后1、6月水上平台潜伏期延迟有统计学或显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1～3。

3 讨论

3.1 不同类型脑震荡鼠空间认知功能损害随时间而加剧

学习记忆过程分为获取、巩固、存贮与提取四阶段。水迷宫是目前国际通用的啮齿类动物空间学习记忆功能的有效评估方法。其逃避潜伏期反映空间学习记忆信息的学习获取、巩固与保存功能，无平台实验则主要评估记忆信息的保存与提取功能。本课题组先前对不同脑震荡大鼠伤后早期（24天）的认知学习行为变化进行了水迷宫实验研究发现：不同损伤类型大鼠伤后早期的空间认知功能恢复时间不同[3-5]。而本次实验首次对伤后长达6个月的空间认知行为变化实施动态观测，结果显示：一次脑震荡（PCC）大鼠在伤后第1月、3月的学习记忆功能与对照组无统计学差异，但至伤后第6月时开始出现学习记忆的获取、巩固与保存功能减退，记忆保存与提取功能出现下降，损害程度达对照组的83.88%。三重脑震荡（3MCC）大鼠的空间学习记忆获取、巩固与保存功能损害（即潜伏期延迟）在伤后第1个月末就出现，且随着时间推移越来越严重，至伤后6个月损害最重的已达到对照组的2.26倍；而信息的保存和提取功能在伤后第3月出现明显损害，损害程度达对照组的73.1%，至伤后第6月这种损害程度达对照组的59.43%。二重脑震荡（2MCC）大鼠的损害变化特征类似3MCC，只是程度稍轻，即记忆的获取、巩固与保存功能损害（即潜伏期延迟）自伤后第1月末偶尔出现，至伤后第6个月损害最重的已达到对照组的1.79倍；而信息的保存和提取功能在伤后第3月出现明显损害，程度达对照组的82.12%，至伤后第6月这种损害程度达对照组的67.15%。

以上实验结果还提示，随着打击次数的增加，空间认知障碍就会较早出现而且越严重，本实验较好再现了大鼠MCC后，发展为慢性创伤性脑病（CTE）出现空间认知功能障碍的动态变化过程，是一个良好的MCC大鼠CTE空间认知研究模型。

3.2 随打击次数增加，空间认知功能异常出现明显累加效应

轻型脑损伤的打击损伤次数是否会出现药理学实验中的“量-效关系”一直是脑损伤研究中的一个热点，本实验研究结果显示：与实验对照组相比，不论在伤后第1、3或第6月，各损伤实验组大鼠的记忆获取、巩固与保存功能不同程度受到损害，表现出完成同一学习任务的速率随脑震荡次数的增加而下降（即潜伏期延迟）。在伤后第1月末，PCC大鼠无差异，2MCC大鼠出现1天明显差异且最严重值是对照组的1.71倍，3MCC大鼠出现2天高度差异且最严重值是对照组的2.36倍、PCC组的2.34倍、2MCC组的1.39倍。在伤后第3月末，PCC大鼠虽然潜伏期存在延迟、但仍无差异，2MCC大鼠出现3天明显差异且最严重值是对照组的1.51倍、PCC组的1.16倍,3MCC大鼠出现4天高度差异且最严重值是对照组的1.87倍、PCC组的1.43倍、2MCC组的1.24倍。在伤后第6月末，PCC大鼠开始出现2天差异且最严重值是对照组的1.37倍，2MCC大鼠出现3天高度明显差异且最严重值是对照组的1.79倍、PCC组的1.30倍，3MCC大鼠出现5天明显差异且最严重值是对照组的2.26倍、PCC组的1.65倍、2MCC组的1.27倍。与此同时，记忆信息的保存和提取功能也表现出类似特征，随脑震荡次数的增加而减弱（在原平台象限的时间减少）。在伤后第1月末，各损伤组均无异常，但2MCC组已轻微下降到对照组的88.23%、3MCC组轻微降到对照组的83.67%。在伤后第3月末，PCC组虽有下降但仍无异常，但2MCC组已显著下降到对照组的82.12%、3MCC显著下降到对照组的73.1%。在伤后第6月末，PCC组明显下降到对照组的83.88%，2MCC和3MCC组已分别显著下降到对照组的67.15%和59.43%。

以上分析可得出轻微脑损伤随着打击次数的增加，其空间学习认知能力的损害具有明显累加效应。

3.3 重复脑震荡诱发空间认知损伤渐进累加的可能机制

在各型脑损伤中近90%的损伤表现为脑震荡（CC）或轻微脑损伤[1]。重复脑震荡可增加再次遭受脑震荡的风险，并延长脑震荡症状的持续时间，重复脑损伤不仅使功能受损的风险增加，同时增加了脑微观解剖结构破坏的风险，脑损伤的累积即可能导致CTE[7]。CTE症状通常在脑损伤后进展多年甚至超过10年，最初的症状包括情感异常（抑郁、冷漠、易激惹、自杀意念和自杀行为）、行为异常（易怒、情绪失控、暴力）、认知异常（学习障碍、记忆障碍）以及其他高级脑功能紊乱，随时间进展平衡障碍、椎体外系症状等运动症状开始出现[8]。

本次通过Morris水迷宫测试（MWM）对不同损伤大鼠的远期空间认知行为评估发现，随着打击次数的增加，不但可以较早地引出大鼠空间认知功能行为的异常，而且还出现了损伤大鼠空间认知功能损害程度的累积效应。本课题组先前对脑震荡大鼠研究发现，该大鼠模型在一次或多次脑震荡后，大鼠中枢神经较广泛区域，如前额叶与顶叶皮质，海马的CA1、CA3和齿状回，基底节，中隔区，丘脑与下丘脑，杏仁核，梨状皮质存在不同程度的部分神经元变性坏死；胼胝体、脑干椎体束部分轴索纤维变性等神经病理学改变，而且这些病理学变化随着打击次数的增加而加重。以上不同脑震荡大鼠的神经病理学改变，很可能就是本次实验现象的病理学基础。

流行病学研究发现外伤性脑损害（TBI）与发展为多种类型的痴呆相关，包括阿尔茨海默病（AD）、Parkinson病（PD），尸检病理检查显示多重轻微脑损伤可表现出淀粉样变、tau蛋白、路易士小体等多重病理改变，临床前研究证实，TBI后多种与神经退行性疾病相关的蛋白累积在大脑，重复性轻微脑损伤的慢性后遗症和典型的神经退行性病变都有共同的神经病理学特征和临床症状[9]。据此我们推测TBI诱发的CTE神经退变可能与AD、PD和多发性硬化症（MS）等神经退行性疾病的发病机制相似或存在交叉，其具体机制需进一步研究。

4 结论

随着脑震荡次数的增加，大鼠出现空间认知行为较早和较严重的损坏，并有明显的损伤累积效应，该模型可用于慢性创伤性脑病病理改变的研究。