溶磷真菌固体发酵菌肥对玉米生长及根际细菌群落结构的影响

陈莎莎，孙 敏，王文超，李 真，王世梅，戴乐天，徐阳春

（南京农业大学资源与环境科学学院/江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室，南京 210095）

磷素是植物生长所必需的矿质营养元素，土壤磷素供给不足是制约植物生长发育的重要因素之一[1]。通常土壤中95%以上磷为无效磷，主要是矿物磷酸盐类，植物很难直接吸收利用。为了保证产量，每年施入大量磷肥，但施入的磷肥当季作物利用率仅为5%～25%[2]，其余依然形成难溶磷，所以提高土壤磷素利用效率一直是科研工作者关注的课题。前人研究发现土壤中存在大量的溶磷微生物，能将难溶磷转化为有效磷。溶磷微生物可分为3大类群：溶磷细菌、溶磷放线菌和溶磷真菌。溶磷能力较强的细菌类群有：芽孢杆菌属（Bɑcillus）、假单胞菌属（Pseudomonɑs），放线菌中链霉菌属（Streptomyces）溶磷能力较强，溶磷能力较强的真菌为青霉菌属（Penicillium）、曲霉菌属（Aspergillus）及AM菌根真菌等[3-7]。

应用溶磷微生物活化土壤磷素是一种安全、经济、有效的农业措施[8]。溶磷微生物通过酸化、螯合和交换反应等方式将土壤磷库中的磷由矿物态转化为可溶态[9]，从而显著提高土壤中有效磷的含量，促进作物生长。Gulden等[10]报道施用拜莱青霉（Penicillium bilɑii）使豌豆植株根毛量增长了22%并对豌豆生长有明显的促进作用。Vessey等[1]也发现在加拿大的两个地区用P.bilɑii接种后，豌豆的根长增加40%，根重提高13%。用该菌株制成的解磷菌剂已在加拿大商品化生产[11]。菌肥不仅促进了作物生长，也对土壤微生物群落产生一定影响。有研究表明菌肥虽然未从本质上改变土壤细菌的种类和分布，但可对土壤细菌的多样性产生影响[12]。李朔[13]利用DEEG技术研究发现，施用细菌复合微生物肥料后增加了白菜田土壤中微生物的多样性。但目前，真菌生物菌肥的研究主要集中于其对土壤理化性质的影响、作物增产和品质改善方面，而对根际土壤细菌群落影响的研究报道较少。

本文以实验室前期从植物根际土壤中筛选出的2株溶磷真菌菌株为材料[14]，研究其在土壤中的溶磷效果，然后经固体发酵后制成生物菌肥，研究其对玉米的促生作用，并测定其对玉米根际土壤细菌群落结构的影响，为高效溶磷菌肥的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

草酸青霉（Penicillium oxɑlicum）NJDL-03和黑曲霉（Aspergillus niger）NJDL-12，溶磷细菌肠杆菌（Enterobɑcter sp.）San8[15]，实验室保存。

1.2 培养基及试剂

（1）PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1000 mL，琼脂20 g，pH值保持自然。

（2）NA培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，H2O 1000 mL，pH值7.0。

1.3 溶磷真菌土培实验

供试土壤采自安徽省滁州市凤阳县安徽科技学院后山（石灰性土壤），其理化性质见表1。

菌株NJDL-03和NJDL-12于PDA平板上涂布培养，于28℃培养4 d后，用无菌生理盐水洗涤制成孢子悬浮液，血球计数板计数孢子数量，使孢子悬液浓度达到106个·mL-1；菌株 Enterobɑcter sp.San8于NA培养液中培养2 d，离心，去除上清液，加入无菌生理盐水，制成San8菌悬液，涂布计数，San8数量达到108CFU·mL-1。分别取NJDL-03、NJDL-12孢子悬液及San8菌悬液50 mL接种到装有250 g过20目筛的土壤中。菌株NJDL-03、NJDL-12及San8每个处理设置5个重复，并设置不接菌对照（CK），各处理置于28℃培养。分别采用钼锑抗比色法[16]和雷兹pHS-3C pH计每周测定土壤速效磷含量和pH值。

1.4 溶磷真菌固体发酵

设计两种发酵培养基。发酵培养基1配方为：玉米芯∶麦麸粉∶蚯蚓粪∶稻壳∶黄豆粉=8∶2∶8∶1∶1，发酵培养基2配方为：玉米芯∶麦麸粉∶稻壳∶菜粕∶黄豆粉=10∶2∶2∶4∶2，料水比均为1∶1。取于28 ℃培养4 d后的NJDL-03和NJDL-12种子液以15%接种量分别接种到装有250 g的2种已灭菌的固体发酵培养基的三角瓶中，每处理5个重复，用玻璃棒搅拌均匀并于28℃培养6 d，随后得到NJDL-03和NJDL-12生物菌肥。

表1 供试土壤的基本理化性质Table 1 The soil basic physical and chemical properties

1.5 溶磷真菌对玉米的促生效果盆栽实验

供试玉米种子品种为京城12，设置CK、Substrate（成分是发酵菌肥的基质）、San8、NJDL-03、NJDL-12 5个处理，每盆装石灰性土壤5.0 kg，每个处理重复5盆。Substrate处理每盆加基质50 g，而San8处理每盆加入含50 mL San8菌悬液（菌数达到108CFU·mL-1）的基质50 g，NJDL-03和NJDL-12处理每盆分别加入相应菌肥50 g。盆栽实验于2015年9月26日至11月19日在南京农业大学资环院温室二楼内进行，测定玉米植株生长状况、用SPAD502叶绿素仪测定玉米叶片叶绿素含量，每个处理随机挑取3盆，每盆6次，取其平均值。土壤蔗糖酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸法比色法；土壤脲酶活性测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法；土壤中性磷酸酶活性按S-NP活性测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）说明书步骤测定。

1.6 玉米根际土壤细菌群落高通量测序

在玉米盆栽实验进行到45 d时，取玉米根际土壤0.5 g，使用强力土壤DNA提取试剂盒（MoBio，Power-Soil DNA Isolation Kit）提取土壤DNA，提取操作参照其说明书。将提取后的DNA送至北京诺禾致源生物信息有限公司进行高通量测序。土壤细菌MiSeq高通量测序参照Caporaso等[17]的方法，引物为563F（5′-AYT GGG YDT AAA GVG-3′）和802R（5′-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3′）。PCR扩增体系为30 μL（2×Master Mix 15 μL；Forward Primer 1 μL；Reverse Primer 1 μL；Template DNA 0.5 μL；ddH2O 12.5 μL），PCR反应条件均为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行27个循环；72℃延伸10 min。

1.7 数据处理与分析

数据整理与计算用Microsoft Excel 2007软件，用SPSS16.0统计分析软件进行数据方差分析与差异显著性检验，显著性水平设定为P＜0.05。

2 结果

2.1 溶磷菌对土壤pH和速效磷含量变化的影响

土培实验，不同处理土壤pH、速效磷随时间的变化结果见图1。石灰性土壤的起始pH为7.84，CK的pH基本维持在7.80上下，而接种溶磷菌处理的土壤pH均有所下降，溶磷细菌San8处理的pH在第24 d下降到最低值7.62，之后回升维持在7.7左右，而NJDL-03和NJDL-12处理均在第10 d就下降到最低值，分别为7.58和7.55，随后保持在7.60左右。可能是到后期，溶磷菌生长达到稳定，产酸能力亦趋于稳定，而石灰性土壤的缓冲性能对土壤pH进行了一定的调节。CK处理土壤速效磷基本没有变化，San8处理土壤速效磷达到最高时仅比CK增加了65.69%。随着培养时间延长，而溶磷真菌处理的土壤速效磷含量变化较大，较CK约提高5倍左右，较San8处理提高3倍左右，且NJDL-03处理土壤速效磷比NJDL-12略高。NJDL-03和NJDL-12处理在第10 d土壤速效磷达到最大值，分别为15.31、14.95 mg·kg-1，随后维持在 13.50 mg·kg-1左右。分析原因，可能由于菌剂接入土壤中，溶解了部分难溶性的磷，使土壤中的速效磷含量有所上升，但随着时间的延长，土壤对磷素的吸附固定加强使速效磷含量减少，土壤磷素循环逐渐达到平衡，速效磷保持相对稳定。

图1 不同处理土壤pH、速效磷随时间的变化Figure 1 The changes of pH and available phosphorus in soil with different treatments over time

真菌 NJDL-12（R2=0.97）和 NJDL-03（R2=0.81）处理下土壤速效磷变化规律与pH负相关，而细菌San8处理下相关性不大（R2=0.32）。

2.2 固体发酵培养基配方比较

NJDL-03和NJDL-12在发酵配方1中发酵孢子数分别达到了4.33×1010个·g-1和1.66×1010个·g-1，而在发酵配方2中发酵，孢子数分别为4.67×109个·g-1和1.33×108个·g-1（表2）。可见固体发酵配方1更适合溶磷真菌的生长，可用作后续盆栽实验的真菌生物菌肥发酵培养基。

2.3 不同溶磷生物菌肥处理对玉米生长的影响

由表3可见，溶磷细菌San8与Substrate处理对玉米生长的影响没有明显差异，而溶磷真菌NJDL-03、NJDL-12与Substrate处理相比，其间差异显著；真菌NJDL-12处理的玉米鲜重高于NJDL-03处理，且差异显著，而干重差异不显著，但与San8处理相比差异显著。NJDL-12、NJDL-03、San8、Substrate处理的玉米植株干重分别较CK增加了67.70%、67.14%、33.96%、24.04%。叶绿素是反映植物生长的重要指标，NJDL-03、NJDL-12处理的玉米叶片叶绿素分别是CK的1.37、1.33倍，而San8处理是CK的1.16倍。

各处理叶片及根系全磷含量规律均为：NJDL-12＞NJDL-03＞San8＞Substrate＞CK。NJDL-12叶片和根系全磷分别为 1.26、1.17 g·kg-1，分别比 CK 增长了132.61%、79.67%，NJDL-03比 CK增长了 80.82%、44.67%，而San8仅增长了59.20%、4.61%，且只有叶片全磷差异显著。图2中，除CK外，真菌NJDL-12和NJDL-03等玉米根系与叶片全磷含量相比各处理均低于叶片，说明溶磷菌肥和基质均能促进玉米生长，且对地上部的促生效果更显著。

2.4 不同处理对土壤速效磷含量的影响

图3显示不同处理土壤速效磷高低顺序为：NJDL-12＞NJDL-03＞ San8＞Substrate＞CK。NJDL-12和NJDL-03处理的土壤速效磷分别为15.87、14.10 mg·kg-1，是 CK的 5.03、4.36倍，而 San8处理及 Substrate处理的土壤速效磷为 4.51、3.43 mg·kg-1，仅较CK提高了0.71、0.30倍。

2.5 不同处理对土壤中性磷酸酶活性的影响

图2 不同处理玉米叶片和根系含磷量比较Figure 2 Comparison of phosphorus content in the leaf and root of maize with different treatments

表2 菌株NJDL-03和NJDL-12在两种固体发酵培养基中的孢子数量Table 2 The number of spores of NJDL-03 and NJDL-12 in different fermentation media

表3 不同处理对玉米生长的影响Table 3 The effect of different treatment on growth of maize with different treatments

图3 不同处理土壤速效磷含量变化Figure 3 Changes of the available phosphorus in soil with different treatments

表4中真菌菌肥处理的土壤蔗糖酶、脲酶及中性磷酸酶活性均高于其他处理，且NJDL-12处理的土壤各酶活性略高于NJDL-03处理，但差异不显著。在土壤蔗糖酶、脲酶及磷酸酶三种酶活中，NJDL-12、NJDL-03分别比San8提高了46.55%、34.74%、25.96%和40.23%、31.48%、15.02%，San8处理则比CK提高了6.78%、18.91.%、35.29%。

2.6 不同处理对根际土壤细菌群落结构的影响

原始序列经过抽提分配后，在97%相似度水平，16SrRNA基因序列共有7624个OUT。不同处理中玉米根际土壤细菌门水平的相对丰度变化显示（图4），根际主要富集了变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria），此三个细菌门的丰度分别达到了50%、20%和10%左右，其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflex）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）及疣微菌门（Verrucomicrobia），约占20%，其中厚壁菌门（Firmicutes）丰度仅占1%～3%，各处理较CK丰度明显降低，有显著差异性。

图4 不同处理中根际土壤细菌门水平的相对丰度Figure 4 Relative abundances of bacterial phyla with different treatments

表5中细菌属丰度＞1%的有23个属，丰度最高的为Gɑiellɑ属，其次为康奈斯氏杆菌属（Conexibɑcter）、Subdivision3_generɑ_incertɑe_sedis 类 群 、Povɑlibɑcter属，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonɑs）、酸土单胞菌属（Aciditerrimonɑs）和土壤红杆菌属（Solirubrobɑcter）等，而丰度＞1%且存在显著性差异的细菌属只有2个属，分别为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonɑs）和类链球菌属（Ohtɑekwɑngiɑ）。San8 处理的土壤 Sphingomonɑs丰度最高，为CK的1.43倍，NJDL-12菌肥处理为CK的1.11倍，NJDL-03菌肥处理与CK差异不显著。Ohtɑekwɑngiɑ丰度除了NJDL-03菌肥处理外，其余各处理均较CK增加。丰度＜1%的9个细菌属各处理之间差异显著，尤其是赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibɑcillus）丰度，各处理均较CK显著降低；其次是丰祐菌属（Opitutus），经真菌菌肥NJDL-03及NJDL-12处理后丰度显著增加，而细菌菌肥San8及Substrate处理后与CK相比差异不显著；分枝杆菌属（Mycobɑcterium）、小囊菌属（Plesiocystis）和嗜盐杆菌属（Hɑlotɑleɑ）的丰度，各处理相对于CK均有明显的增加，真菌菌肥处理后的溶杆菌属（Lysobɑcter）相对于CK有所减少。

3 讨论

土壤中存在大量的溶磷菌，对活化土壤磷素起到重要的作用。溶磷草酸青霉NJDL-03和黑曲霉NJDL-12是实验室分离保存的溶磷效果较好的微生物。将溶磷生物菌肥接种到石灰性土壤中进行土培，降低了土壤pH值，提高了土壤速效磷含量。土培实验45 d，菌株NJDL-03和NJDL-12处理土壤的速效磷分别是CK的4.0、3.9倍，San8处理则是CK的1.54倍，表明真菌的溶磷效率远高于溶磷细菌。Kucey等[18]研究亦发现真菌的溶磷能力要强于细菌。前期摇瓶实验发现菌株NJDL-03主要产生草酸、甲酸、酒石酸、柠檬酸等，产生有机酸总量4489 mg·L-1，NJDL-12主要产生草酸、甲酸、苹果酸等有机酸，产酸总量为10 331 mg·L-1[15]；而菌株san8主要产生草酸、甲酸、苹果酸、乳酸等有机酸，其产酸总量为4153 mg·L-1[16]。可见菌株产生有机酸的种类及数量不同，是其溶磷能力不同的主要原因，王岳坤等[19]研究报道不同的有机酸对土壤中难溶性磷的溶解效率不同。

表4 不同处理中土壤酶活性的变化Table 4 The changes of soil enzyme activity with different treatments

表5 不同处理根际土壤主要细菌类群（属水平＞0.1%）的丰度变化Table 5 The abundance of main bacterial genera in different treatments

本实验结果表明，生物菌肥的应用增加了土壤速效磷含量，提高了土壤酶活性，并促进了玉米植株的生长。为进一步深入探索生物菌肥溶磷促生的机制，本实验检测了玉米根际细菌群落的变化，研究发现所有处理在门水平均具有相同的三大优势菌群，分别为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）。这与韩亚飞等[20]研究的变形菌门、放线菌门和酸杆菌门为不同类型土壤的优势群落的结果一致。经统计分析发现，变形菌门、酸杆菌门的丰度与土壤速效磷含量及土壤酶活变化有显著的相关性。李丹[21]研究发现在不同土地利用方式下，土壤细菌群落中拟杆菌门及δ-变形菌门与脲酶呈负相关，蓝藻及疣微菌与脲酶和过氧化氢酶呈正相关。这说明土壤细菌群落结构变化与土壤理化性质紧密相关。

在细菌属水平，虽然有些细菌属丰度很低，但其具有一些特殊作用，对土壤理化性质的改变及植株的生长不可忽视。各处理的植株根际赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibɑcillus）丰度相对于CK均减少，据文献报道Lysinibɑcillus具有较强的诱导碳酸盐矿物形成能力，并且细菌死亡后的自溶过程会使环境pH值升高[22]。菌肥处理后，根际中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonɑs）、小囊菌属（Plesiocystis）丰度较对照有所增加，其中Sphingomonɑs是土壤中一类重要的资源微生物，不仅具有较强的降解多环芳烃的能力[23]，更具有溶磷作用[24]，Plesiocystis则是生态环境中磷酸酯和磷酸酶的分解细菌[25]。此实验结果说明经过溶磷生物菌肥处理之后，对根际细菌群落组成有所改变，增加功能微生物的丰度，有利于土壤磷素的溶解，促进植物生长。

目前功能生物肥料的研发、生产已取得了丰硕成果，但由于不同土壤理化性质的差异，其应用效果稳定性仍需进一步提高，故本文的实验结果为溶磷生物菌肥在生产上应用提供了理论参考。

4 结论

（1）溶磷真菌NJDL-03和NJDL-12的溶磷效果高于溶磷细菌San8。

（2）施加不同的溶磷生物菌肥皆能促进玉米生长，促生效果顺序是NJDL-12＞NJDL-03＞San8＞Substrate＞CK，生物菌肥处理不仅改善了土壤理化性质，同样提高了某些功能微生物的丰度，进而影响了根际土壤细菌群落组成。