P16、RB在甲状腺良恶性结节中的表达差异性研究

胥 柯，蒋浩海，王春雷，刘艳梅

(盐城市第一人民医院 内分泌科，江苏 盐城224000)

甲状腺结节(TN)一般是经触诊或超声检查时发现[1]。由于TN发病率较高，起病隐匿，且病程缓慢，漏诊误诊率一直较高。虽然大多TN患者为良性结节，但是仍有5%-10%的患者为恶性癌变[2]。而且近几年甲状腺微小癌的发病率逐年升高，更增加了恶性TN的诊断难度[3]。超声检查一直是筛选甲状腺癌的首选手段[4]，本项研究旨在通过探讨甲状腺结节患者超声表现与P16、RB等标志性分子的关系，对甲状腺良、恶性结节进行区分，并对预后进行评估，为选择合理的治疗方案提供理论支持。

1 资料与方法

1.1主要仪器和试剂

BLS-X6彩色多普勒超声诊断仪(购自徐州贝尔斯电子科技有限公司有限公司)；BX12A-VS金相图像分析系统(购自上海中恒仪器有限公司公司)；金图文医学影像处理分析系统(购自武汉超声医学科技发展中心)；凝胶成像仪(购自复日科技有限公司)；UV-8000紫外分光光度计(购自上海精密仪器仪表公司公司)；CX41倒置光学显微镜和OLS4100激光共聚焦显微镜(购自日本奥林巴斯医疗公司)。

P16，RB兔抗人多克隆抗体(购自Sigma公司)。

1.2患者临床资料

本项研究选取2014年1月至2017年3月期间在我院内分泌科或普外科接受手术治疗的TN患者251例，共获取251个结节标本。其中99例患者为良性结节(男15例，女84例)，152例患者为恶性结节(男33例，女119例)。年龄为18-60岁，平均年龄为(39.25±7.63)岁；病程为1个月-17年，平均病程为(4.98±5.26)年。两组患者一般临床资料比较，无统计学差异，具有可比性。

1.3检查方法

二维超声检查甲状腺：患者取仰卧位，充分暴露颈部，多轴位扫描患者甲状腺以及锁骨上和颈部淋巴结。观察甲状腺结节数量、大小、位置、形态、回声强度和均匀性，有无声晕和囊变。

彩色多普勒超声(CDFI)扫描甲状腺：观察甲状腺结节的血流情况。

1.4手术切除方式

良性组：采取手术方式切除结节。

恶性组：甲状腺乳头癌患者完全切除病灶腺体和峡部以及部分对侧腺体，同时清扫颈部淋巴结。甲状腺滤泡状腺癌完全切除病灶腺体和峡部以及部分对侧腺体，若无淋巴结肿大，则不作处理。对于病灶微小的未分化癌，进行根治性切除。

1.5免疫组织化学检查

病例样本采集：按照病理编号调出我院病理科存档甲状腺癌患者的石蜡包埋组织切片。分别采用HE染色和免疫组织化学染色(SP免疫组化)。免疫组化法按照试剂盒说明书标明的实验步骤进行。

脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶1(Ape1)结果判定标准，将阳性细胞率分为：0分(阳性率为0)，1分(阳性率≤25%)，2分(阳性率25%-50%)，3分(阳性率50%-75%)，4分(阳性率>75%)。同时观察细胞染色强度：0分(阴性)，1分(弱染色)，2分(中度染色)，3分(强染色)。将两种评定分数相加，根据总分数将切片分为1-4级：1级(0-1分)，2级(2-3分)，3级(4-5分)，4级(6-7分)。1级和2级为Ape1低表达，2级和3级为Ape1高表达。

免疫组化结果评定标准：将经染色的病理片，放置在400倍视镜下观察，随机选择10个视野，并且将图像输入医学影像处理分析系统，测定平均灰度值和面数密度值。

1.6统计学处理

2 结果

2.1两组患者病理检查结果

病理结果显示，良性组患者大部分(61.62%)为结节性甲状腺肿大患者，少部分(38.38%)为腺瘤患者。而恶性组患者大部分(63.82%)为乳头状癌患者，28.29%患者为滤泡癌，仅有7.89%为未分化癌。见表1。

表1 两组患者病理检查结果(n，%)

2.2二维超声检查结果

经二维超声扫描甲状腺结果，良性组患者结节边界清晰，多见粗大钙化灶，一般呈弧状或环形排列，纵横径比<1，多数内部回声以囊性为主，无淋巴结肿大。而恶性组患者，结节形状不规则，边界模糊，内部回声多以低回声为主，常见沙粒状微小钙化灶，纵横径比≥1，多见淋巴结肿大。

仅用边界清晰度作为诊断TN良性结节的敏感性为100%，而诊断恶性结节的敏感性仅为41.45%。仅用内部回声作为诊断TN良性结节的敏感性为96.97%，而诊断恶性结节的敏感性为94.08%。仅用微小钙化灶作为诊断TN良性结节的敏感性为100%，而诊断恶性结节的敏感性为80.26%。仅用纵横径比作为诊断TN良性结节的敏感性为94.95%，而诊断恶性结节的敏感性仅为23.03%。见表2。

表2 二维超声检查结果(n，%)

2.3CDFI检查结果

经CDFI检查结果显示，血流丰富度对于诊断TN良性结节的敏感性为100%，而诊断恶性结节的敏感性仅为66.45%。阻力指数对于诊断TN良性结节的敏感性为96.97%，而诊断恶性结节的敏感性仅为64.47%。见表3。

表3 CDFI检查结果(n，%)

2.4免疫组化检测结果

良性组患者不表达P16和RB癌基因，恶性组患者P16基因的阳性表达率为78.29%，RB基因的阳性表达率为81.58%。见表4。

2.5二维超声检查结果与恶性组患者P16、RB癌基因表达的关系

低回声、微钙化、纵横径比≥1的患者P16和RB癌基因的阳性表达率明显高于阴性表达率，P<0.05。而结节边界不清组患者RB癌基因的阳性表达率也高于阴性组，P<0.05。见表5。

表4 免疫组化检测癌基因表达结果(n，%)

表5 超声检查结果与P16癌基因表达的关系(n，%)

注：*与阳性表达组比较，P<0.05；

2.6CDFI结果与恶性组患者P16、RB癌基因表达的关系

高阻力指数(≥0.7)、血流丰富的患者P16和RB癌基因的阳性表达率明显高于阴性表达率，P<0.05。见表6。

表6 CDFI检查结果与P16癌基因表达的关系(n，%)

注：*与阳性表达组比较，P<0.05；

3 讨论

甲状腺结节一般是通过触诊或者超声检查与周围甲状腺组织有明显差别的孤立性病变，80%-90%的TN患者为良性结节，少部分患者可确诊为恶性癌变[5]。有流行病学调查结果显示，非缺碘地区，TN的发病率约为5%左右，由于发病前期没有明显的临床指征，且病情进展缓慢，因此，漏诊的可能性较高，应用超声检查确诊率仅为20%-30%，而尸检时，TN的发生率可高达65%以上；而甲状腺癌的确诊率更低[6,7]。

甲状腺癌变是一个阶梯性过程，包括癌基因突变、生长因子调控以及肿瘤组织的克隆[8]。经超声检查，发现甲状腺结节边界清楚、表面光滑、质地坚韧、有微小钙灶、颈部淋巴结出现肿大情况时，可怀疑结节有癌变的可能[9,10]。本项研究结果也证实，经二维超声扫描甲状腺结果，良性组患者结节边界清晰，多见粗大钙化灶，一般呈弧状或环形排列，纵横径比<1，多数内部回声以囊性为主，无淋巴结肿大。而恶性组患者，结节形状不规则，边界模糊，内部回声多以低回声为主，常见沙粒状微小钙化灶，纵横径比≥1，多见淋巴结肿大。仅用边界清晰度、内部回声、微小钙化灶或者纵横径比作为诊断TN良性结节的敏感性分别为100%、96.97%、100%、94.95%，而诊断恶性结节的敏感性分别为41.45%、94.08%、80.26%、23.03%。说明二维超声虽然一直是临床上最常用的诊断TN的手段，对于甲状腺良性结节检出的敏感性较高，但是对于诊断恶性癌变的敏感性相对较低。

甲状腺癌是目前发病率增长速度最快的恶性肿瘤之一，病理分类较为复杂[11]，因此，采取的治疗方案和预后也存在较大差异。近些年，随着超声技术的提高，以及CDFI的广泛应用，TN的检出率大大提高[12]。但是经常会有良性结节和恶性结节并存的情况，因此会增加恶性癌变的检出困难[13]。进行CDFI检查时，血流丰富度和阻力指数对于诊断TN良性结节的敏感性为100%、96.97%，而诊断恶性结节的敏感性仅为66.45%和64.47%。说明，CDFI虽然提高了甲状腺结节的检出率，但是对于恶性结节的辨别程度仍然不甚理想，漏诊的几率较大。P16和RB属于抑癌基因，对细胞周期具有重要的调节作用[14]。有研究证实，检测P16和RB基因是否突变可作为判断甲状腺癌变的重要参考指标之一。甲状腺癌的发生发展与P16和RB蛋白的缺失密切相关，且缺失越严重，肿瘤的分化程度越差[15]。本项研究显示，良性组患者不表达P16和RB癌基因，恶性组患者P16基因的阳性表达率为78.29%，RB基因的阳性表达率为81.58%。低回声、微钙化、血流丰富、纵横径比≥1的患者P16和RB癌基因的阳性表达率明显高于阴性表达率，P<0.05。而结节边界不清组患者RB癌基因的阳性表达率也高于阴性组，P<0.05。另外，高阻力指数(≥0.7)、血流丰富的患者P16和RB癌基因的阳性表达率明显高于阴性表达率，P<0.05。

综上所述，二维超声和彩色多普勒超声检查，对判定甲状腺的良性结节具有高敏感性，是鉴别甲状腺良恶性结节和早期诊断甲状腺癌的有效手段之一，但是对恶性结节的诊断率相对较低，这就需要从分子水平检查并确诊甲状腺结节是否发生恶性病变，P16和RB基因在甲状腺良性和恶性结节中的表达存在明显差异，可作为判断甲状腺癌变的重要参考指标。