柴达木黑果枸杞原花青素对小鼠衰老皮肤抗氧化作用及炎症因子的影响※

王 刚，罗文娟，冶 娟， 燕华玲

(青海大学附属医院皮肤科，西宁 810001)

近年来对柴达木黑果枸杞的研究主要集中在抗氧化方面。本研究探讨柴达木黑果枸杞原花青素对皮下注射5%D-半乳糖(D-gal)联合紫外线(长波紫外线UVA+中波紫外线UVB)照射后小鼠皮肤抗氧化作用及炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF及KM雌鼠50只，45日龄，体重18～22 g，购于西安交通大学实验动物中心，动物合格证号：0001209。

1.2 主要试剂与仪器

柴达木黑果枸杞原花青素粉末(西安瑞林生物公司)，水溶性维生素E粉末、D-半乳糖(北京索莱宝生物公司)，SOD、GSH、CAT试剂盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠IL-1、IL-6酶联免疫吸附测试盒(武汉基因美生物科技有限公司)。infinite M200PRO酶标仪(TECAN公司)，紫外线辐照仪(北京精密仪器有限公司)，UVA、UVB灯管(峰波长值分别为340、313nm，南京卡知电子科技有限公司)，DU800分光光度计(BECKMAN COULTER公司)，手持匀浆仪(无锡沃信仪器有限公司)，BB150二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，SIGMA 3K15离心机(SIGMA公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及脱毛

将50只小鼠随机分为5组：正常组，模型组，维生素E组，原花青素低剂量组，原花青素高剂量组。剪去小鼠颈背部长毛，用双蒸水和75%酒精为溶媒配置4%的硫化钠溶液，均匀涂抹于颈背部毛发上，范围约2 cm×3 cm，待毛发略透明呈淡黄色后(约6～8min)，用棉球擦去毛发、流动温水冲洗。

1.3.2 模型的建立

除正常组外，其余组以5% D-gal于颈背部皮下注射(10mL/kg·d)，隔日进行UV照射：将UVA、UVB灯管各一支平行安插在自制照光箱中，距鼠约40 cm高处，以最小红斑量开始照射，照射前预热灯管15 min，照射40 min，隔日1次，持续造模40 d(UVA累计辐照剂量为98.4J，UVB累计辐照剂量为78.4J)。正常组小鼠在室温光照下饲养。实验始至第11天按分组给予不同溶液灌胃(3mL/只·天)：维生素E组给予维生素E(50mg/kg·d)，原花青素低剂量组给予低量原花青素(50mg/kg·d)，原花青素高剂量组给予多量原花青素(100mg/kg·d)，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.3.3 取材及10%组织匀浆的制备

造模第41天，对小鼠行腹腔麻醉，冰上快速取下颈背部造模处皮肤组织，钝性剥除皮下脂肪及其他结缔组织，漂洗，拭干，精密称重，置于试管中，加入9倍预冷生理盐水，在冰水浴中匀浆，制备组织匀浆(10%)，离心(3500r/min)15 min，取上清液进行相关指标检测。

1.3.4 指标检测

严格参照相应试剂盒说明书以酶生化法检测皮肤组织上清液中SOD、GSH-PX、CAT活力，用双抗体夹心ELISA法检测IL-1、IL-6含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 皮肤组织上清液SOD、CAT活力及GSH-PX含量的改变

模型组SOD、CAT活力和GSH-PX含量较正常组降低(P<0.05)；与模型组相比，经维生素E及原花青素灌胃后皮肤组织上清液中的SOD、CAT活力和GSH-PX含量有不同程度升高(P<0.05)；原花青素低剂量组和高剂量组SOD、CAT活力和GSH-PX含量较维生素E组升高更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

Table 1Comparison of the contents of SOD，CAT and GSH-PX among different

*：与正常组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与维生素E组比较，P<0.05。

2.2 各组IL-1和IL-6含量的变化

模型组IL-1、IL-6含量较正常组升高(P<0.05)；维生素E组、原花青素低剂量组、原花青素高剂量组的IL-1、IL-6含量较模型组有不同程度的降低(P<0.05)；原花青素低剂量组、高剂量组IL-1、IL-6含量较维生素E组降低幅度更大，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2 表2

Table 2Comparison of the skin contents of IL-1 and IL-6 among in different

*：与正常组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与维生素E组比较，P<0.05。

3 讨论

皮肤老化按其来源可分为内源性和外源性老化两种形式[1]。内源性老化受基因调控，取决于细胞的自然老化过程。外源性老化主要受外界因素的影响，其中最主要因素是紫外线辐射。紫外线是波长为100～400 nm的一组光源，按波长可分为长波紫外线(UVA 320～400nm)、中波紫外线(UVB 280～320nm)、短波紫外线(UVC 100～280nm)。平流层的臭氧可吸收波长小于290 nm的紫外线，因此真正能够到达皮肤表皮的是UVA和UVB[2]。本研究以小鼠为研究对象，采用5% D-gal连续皮下注射联合UV照射小鼠颈背部脱毛区域，共同建立小鼠皮肤衰老模型，综合内、外源性因素共同作用导致皮肤老化，全面的模拟皮肤衰老的真实自然状态。

正常情况下，机体内氧化与抗氧化系统处于平衡状态，当这种平衡被打破时，机体即表现出氧化损伤，其中SOD、GSH、CAT等抗氧化酶反映了机体抗氧化水平。既往研究表明，长期大量注射D-半乳糖及辐射过量的紫外线均可促使机体生成许多活性氧(ROS)，攻击体内的抗氧化酶系统，导致氧化与抗氧化反应失衡，使得体内抗氧化酶消耗增多、含量降低、脂质过氧化产物蓄积[3-4]。ROS的蓄积可导致细胞组成成分如细胞膜、线粒体、DNA氧化损伤，激活细胞因子和生长因子受体[5-6]。相关研究表明，UV照射可激活NF-kB通路和AP-1的表达，促进炎性细胞因子IL-1B、TNF-a、IL-6、IL-8及各种黏附因子的表达，这些炎性细胞因子的激活进一步扩大NF-kB通路和AP-1的表达，增强UV对皮肤的损伤[7]。本实验中，经过5%D-半乳糖联合UV(UVA+UVB)照射后，模型组皮肤组织上清液中SOD、CAT活力值及GSH含量值明显下降，IL-1、IL-6含量升高，说明UV和D-半乳糖可破坏机体的酶防御系统，上调炎症因子IL-1、IL-6的表达，造成机体的损伤，加速皮肤的老化。给予原花青素、维生素E灌胃处理后皮肤组织上清液中SOD、CAT活力和GSH含量值与模型组相比有不同程度的升高，IL-1、IL-6的表达均明显下降；且原花青素低、高剂量组较维生素E组效果更明显。说明黑果枸杞原花青素及维生素E均可保护小鼠机体的酶防御系统，不同程度地提高机体抗氧化损伤的能力，增加体内抗氧化物质的活性和含量，降低炎症因子的表达，减轻对小鼠皮肤的损伤，延缓皮肤衰老。黑果枸杞原花青素的抗老化效果显著高于维生素E，并表现出一定的浓度依赖关系。

综上所述，柴达木黑果枸杞原花青素及维生素E均能减轻D-半乳糖和紫外线对小鼠皮肤的损害，减缓小鼠皮肤衰老的进程，这与增加抗氧化酶活性及含量，同时下调IL-1、IL-6的表达，减轻氧化应激反应及炎症反应有关。本实验以青海地区自然环境及本地药物资源为出发点，为青海柴达木黑果枸杞原花青素的抗老化作用提供实验依据。因本实验研究条件有限，未做深入研究。下一步拟从基因表达、相关信号转导通路方面开展研究。