利用HS-SPME/GC-MS法对云南主产区生咖啡豆中挥发性成分萃取与分析研究

董文江，胡荣锁，宗 迎，龙宇宙，赵建平

（1中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南万宁571533；2国家重要热带作物工程技术研究中心，海南万宁571533；3海南省热带香料饮料作物工程技术研究中心，海南万宁571533）

0 引言

咖啡原产于埃塞俄比亚，与可可、茶叶并称世界三大饮料，其产量、产值和消费量均居三大饮料作物之首，在国际贸易中是仅次于石油的第二大原料型产品，香气被认为是咖啡最重要的属性之一[1-2]。在咖啡植物品种中‘阿拉比卡’（即小粒种咖啡）已被报道为最具芳香气味的品种，它通常用于生产卓越品质的冲泡咖啡。中国咖啡的主产区位于海南和云南地区，其中98%的咖啡出自云南[3]。云南热区的自然条件与世界上质量最好的咖啡产地——哥伦比亚十分相似，即低纬度、高海拔、昼夜温差大。云南种植的主要是小粒咖啡，具有浓而不苦、香而不烈、略带果酸味的特点，可与世界上最好的蓝山咖啡媲美，曾被国际咖啡组织(International coffee organization，ICO)评为一类产品[4-6]。

生咖啡豆中的化学组分由于烘焙发生一系列反应（如美拉德和焦糖化反应等）才能形成咖啡特有的风味，而生咖啡豆中挥发性成分较少。目前，国外科学工作者已经鉴定出生咖啡豆中绝大部分的挥发性物质，并对咖啡的特征香气物质进行了研究。Toci等[7]采用HS-SPME/GC-MS对巴西生咖啡豆中的挥发性物质进行分析，共鉴定出43种挥发性物质；Franca等[8-10]研究了生咖啡豆中风味前体物质（葫芦巴碱、绿原酸、咖啡因、蔗糖、蛋白质等）的含量与咖啡风味品质之间的关系。近年来，国内对小粒咖啡的研究多为复合栽培、病虫害防控以及烘焙特性方面，对于云南主产区生咖啡豆的挥发性成分研究未见报道。张丰等[11]对云南不同地区3个烘焙度的烘焙豆挥发性成分进行了研究，检测出65种挥发性成分，其中呋喃类物质相对含量最高，PCA和HCA可用来区分不同地区烘焙咖啡，酸类物质可作为区分普洱同保山、临沧地区样品的判别指标，吡嗪类、呋喃类和酮类与临沧地区样品相关性较高，与保山地区样品相关性较高物质主要为吡啶类。烘焙豆与生豆的挥发性成分有差异，生豆中的挥发性成分通过烘焙过程中的美拉德反应、焦糖化反应等会转化为烘焙豆的芳香物质，笔者在其研究基础上进一步补充完善。同一品种的‘阿拉比卡’样品在不同产区的品质差异显著，由于咖啡种植具有较强的地域性，种植模式、气候条件、海拔高度对咖啡香气影响较大[12]。

咖啡为中国云南地区的高原优势特色资源，不同主产区特殊的地理环境导致其风味成分不同，进而影响产品的风味品质和商业价值，因此有必要对不同地区生咖啡豆样品中挥发性成分进行分析。笔者以云南保山(BS)、德宏(DH)、临沧(LC)和普洱(PE)4个主产区生咖啡豆为试材，采用HS-SPME/GC-MS对挥发性成分进行分析，利用系统聚类分析和主成分分析统计学方法对样品进行区分，寻找对不同地区生咖啡豆品质影响较大的特征化合物，旨在为云南地区咖啡豆的风味品质提升及产地追溯提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 生咖啡豆来源于云南省4个咖啡主产区，包括保山咖啡（云南保山佐园咖啡庄园，BS，编号：1～3号）、德宏咖啡（云南德宏热带农业科学研究所，DH，编号：4～6号）、临沧咖啡（云南临沧凌丰咖啡产业有限公司镇康分公司，LC，编号：7～9号）、普洱咖啡（云南普洱曼老江农业开发有限公司，PE，编号：10～12号）。湿法加工处理得到生咖啡豆。C7～C30正构烷烃标准品（纯度99.5%；美国Sigma公司）

1.1.2 仪器 VTA6S3型咖啡粉碎机，德国MAHLKONIG仪器公司；Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；固相微萃取装置和萃取头(75 μm CAR/PDMS)，美国Supelco公司

1.2 试验方法

1.2.1 HS-SPME萃取法 固相微萃取头插入在气相色谱仪进样口老化，温度为300℃，老化时间为1 h，备用；精确称量1.5 g生咖啡豆粉末样品（过40目筛）于20 mL采样瓶中，加盖密封，置于恒温水浴锅中预热20 min。将萃取头插入采样瓶中吸附30 min，取出，插入250℃的GC-MS进样口解吸3 min。

1.2.2 气相色谱-质谱(GC-MS)测定[13]

（1）色谱条件。DB-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm× 0.25 μm)；载气为氦气，流速为1.0 mL/min，不分流进样，时间为3 min。程序升温40℃保持2 min后以1.5℃/min升至130℃，之后以4℃/min升至200℃，保持5 min；检测器温度(EI)为230℃，进样口温度为250℃。

（2）质谱条件。电喷雾离子源，其中离子源温度、接口温度、电子能量和扫描范围(m/z)分别为230℃、250℃、70 eV和35～350 amu。

1.2.3 生咖啡豆中挥发性物质的定性和定量分析

（1）定性。采用GC-MS的NIST08谱库，结合匹配度(＞85%)以及参考文献对生咖啡豆中挥发性物质进行定性分析。

（2）定量。根据总离子流图检索NIST08谱库结合参考文献分析咖啡生豆挥发性特征组成，应用峰面积归一化法计算组分相对百分含量。

1.2.4 统计学分析

（1）主成分分析(principal component analysis，PCA)是将多个变量通过线性变换，利用数据降维，线性组合得到前几个主要变量的一种多元统计分析方法。采用SPSS 20.0提供的主成分分析法，将数据进行标准化处理，做因子分析，得到主成分的方差贡献表，选择主成分个数(PC)[14]。求出不同变量相应的主成分特征向量，特征向量和标准化数据乘积即变量的主成分负荷量，然后求出该样品的主成分得分对样品的特性进行推断和评价。

（2）系统聚类分析(hierarchical cluster analysis，HCA)是研究样品分类常用的一种多元统计分析方法，用于评价不同类别样品间的差异以及样品间的聚类分布和亲缘关系。在本研究中，原始数据先经过归一化后再输入至系统平台运算，利用SPSS 20.0软件提供的系统聚类法，计算出欧式距离，画出树状图，依此来判断各地区样品的亲缘关系远近，并与PCA的分类结果进行对比。

2 结果与分析

2.1 4个地区生咖啡豆挥发性成分及相对含量的比较

利用上述的HS-SPME条件结合GC-MS对云南不同地区生咖啡豆挥发性物质进行分析。通过与NIST08标准谱库对照，结合相关文献报道，共鉴定出42种挥发性物质，主要为酸类、酮类、醇类、碳氢类、酯类、醛类等几类化合物，该结果与文献报道一致[15-18]。不同地区生咖啡豆挥发性成分的总离子流图如图1所示。从图1可看出，德宏(DH)地区中峰的个数和强度都要大于其他3个地区，其次是保山(BS)地区，临沧(LC)和普洱(PE)地区中峰的个数较少，即挥发性成分相对较少。

图1 云南不同地区生咖啡豆的GC-MS总离子流图

对各成分进行定性定量分析，利用GC-MS自带的NIST08谱图库检索，共鉴定出42种挥发性成分，采用峰面积百分归一化法对各成分进行定量分析。色谱峰对应的挥发性物质及各类化合物含量对比如表1和图2所示。表中结果显示，共分离鉴定出42种挥发性物质，其中酸类8种、酮类3种、醇类10种、碳氢类2种、酯类5种、醛类2种、吡嗪类5种、含硫化合物4种、酚类2种以及吡啶类1种化合物。在保山(BS)、德宏(DH)、临

沧(LC)和普洱(PE)4个地区的生咖啡豆中在检测限范围内共匹配出7种共有挥发性成分，分别是3-甲基丁酸(28.11%)、乙醛(7.31%)、乙酸甲酯(2.08%)、2-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯(5.31%)、丙醇(8.99%)、1-丁醇(0.91%)和苯甲醇(2.33%)。

表1 不同地区生咖啡豆的挥发性成分及其相对含量

从4个地区样品中分别鉴定出22种、36种、13种和14种挥发性成分，其中，酸类物质会影响咖啡风味口感，德宏地区种类最多且含量也最高，临沧和普洱地区含量接近，都非常少[19]，在不同地区的相对含量排序是PE＞BS＞DH＞LC，普洱地区咖啡中酸类物质含量高达54.581%；酮类物质会产生青草香气，其相对含量排序是LC＞BS＞PE＞DH，临沧地区咖啡中酮类含量占总量一半，而德宏地区咖啡中未检测出酮类物质；醇类物质的相对含量都比较少，但是检测出的种类较多，其中丙醇、1-丁醇和苯甲醇3种物质为共有物质，丙醇含量较高；酯类物质的相对含量排序是BS＞LC＞PE＞DH；醛类物质在烘焙后会大量产生，生豆中乙醛含量较多，德宏和普洱地区含量相似，保山地区最少；吡嗪类物质是具有较强气味的芳香类化合物，在烘焙后表现为烘烤味和泥土味[20]，德宏地区含量最高，而普洱地区未检测到；含硫化合物的含量虽然不多却对咖啡风味形成起重要作用，其中2-糠基硫醇具有烘烤味和肉汤味，在高温下容易形成[21]，德宏地区含量最高，其他地区含量相似；酚类物质中的4-乙烯基愈创木酚具有丁香味和香辛料气味，愈创木酚具有塑料味和烟熏味[22]，两者含量均较低，前者只在保山地区检测得到，后者只在德宏地区检测得到；吡啶类物质只在德宏地区检测得到且含量非常少，其在烘焙后会产生焦糊味和饼干风味[23]。

续表1

图2 不同地区样品中挥发性物质含量对比图

2.2 生咖啡豆的主成分分析

以12个样本的10类挥发性物质相对含量构成12×10矩阵，采用SPSS 20.0数据处理系统解出的主成分全部方差解析表2和主成分因子得分表3。从表2可以看出，当提取主要因子达到2时，方差贡献率77.99%，前2个因子可反映大部分样品原始信息。

表2 PCA的全部方差解析表

表3 PCA的特征向量和载荷表

从表2中可看出，PC1的方差贡献率为48.247%，PC2的方差贡献率为29.747%，且前2个PC的累计方差贡献率为77.994%，表明前2个主成分可解释原始数据的大部分信息，故选择前2个PC用于后续统计分析。由表3可知，提取出10种主要成分，第一主成分[式(1)]主要反映吡嗪类、酸类、醛类和碳氢类的信息；第二主成分[式(2)]用于表示醇类和酚类物质的原始信息。不同地区样品与挥发性成分的相关性可根据载荷的相对位置来判断，载荷为矢量，既有大小又有方向，距离样品越近、在PC1和PC2方向上值越大，则与样品的相关性越大。载荷用于解释各变量与PC间的相关性大小见表3，PC1与吡嗪类和酸类物质相关性最大，醛类和碳氢类物质次之，而与含硫化合物、酮类、醇类和酯类物质呈负相关性；PC2与醇类和酚类物质相关性最大，酸类和吡嗪类物质次之，与酮类、碳氢类、酯类和含硫化合物负相关。综合分析各成分作用大小，酸类、酮类、醇类和碳氢类是4个地区生咖啡豆的主要挥发性物质。由表3～4可知，与保山地区相关性较高的有酮类和醛类，德宏地区的有醇类、酯类和酚类，临沧地区的有酸类、吡嗪类和碳氢类，普洱地区的有吡啶类和含硫化合物。从而，可以用挥发性物质作为区分4个地区生咖啡豆的参照。

表4 主成分因子分析

图3是以第一主成分为纵坐标，第二主成分为横坐标获得的生咖啡豆主成分二维散点图，10种挥发性成分分为3类，第1类有酸类、醇类、酯类、酚类、吡嗪类和碳氢类，第2类有吡啶类和含硫化合物，第3类有酮类和醛类。2个主成分即可反映生咖啡豆挥发性物质的基本特征。图4是以前2个主成分为x轴和y轴获得的不同地区主成分分析二维散点图，每个地区的样品各自聚为一类，其中德宏地区样品位于第一象限，保山地区样品位于第二象限，普洱地区样品位于第三象限，临沧地区样品位于第四象限，4个地区的样品分别位于不同象限，各自聚为一类，说明主成分分析能够反映不同地区生咖啡豆的基本特性。

图3 生咖啡豆的PCA二维载荷投影图

图4 生咖啡豆的PCA二维得分投影图

2.3 不同地区生咖啡豆的系统聚类分析

将表1的数据进行标准化处理，利用SPSS 20.0软件对标准化后的数据矩阵进行聚类分析，构建4个地区样品间的亲缘关系树状图，图5是以挥发性物质数据矩阵（12个样品×10个变量）为输入变量的聚类分析树状图。

从图5中可看出，BS、DH、LC、PE 4个地区样品间欧式距离较短，BS和LC地区样品距离最近，PE和DH地区样品距离较近，DH和LC地区样品距离较远，PE和LC地区样品距离最远，但每个地区之间亲缘关系不是很近，按各自特性分别聚为一类，当欧式距离为1.0时即可将4个地区样品完全区分开，这与PCA分析结果一致，表明可用此方法鉴别不同地区的生咖啡豆。

3 结论

（1）采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(HSSPME/GC-MS)技术对云南4个地区（保山、德宏、临沧和普洱）生咖啡豆的挥发性成分进行了分析，共分离鉴定出45种香气物质，4个地区依次鉴定出23种、37种、13种和14种挥发性成分，其中呋喃类7种、酮类3种、醇类9种、碳氢类2种、酯类5种、醛类2种、吡嗪类5种、酸类5种、含硫化合物4种、酚类2种、吡啶类1种。其中保山地区的醇类和酯类相对含量较高，德宏地区的碳氢类、酸类、吡嗪类和含硫化合物相对含量较高，临沧地区的酮类和醛类相对含量较高，普洱地区的呋喃类相对含量较高。4个地区共有成分有7种，分别为3-甲基丁酸、乙醛、乙酸甲酯、2-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、丙醇、1-丁醇和苯甲醇，占总挥发性物质的54.86%。

图5 以挥发性成分数据矩阵为输入变量的聚类分析树状图

（2）PCA的第一主成分贡献率为48.247%，第二主成分贡献率为29.747%，前2个主成分可以反映不同地区生咖啡豆的主要挥发性物质，还可以利用挥发性物质区分不同地区的生咖啡豆。酮类和醛类物质可作为区分保山和其他3个地区的判断指标，醇类、酯类和酚类物质可作为区分德宏和其他3个地区的判断指标，酸类、吡嗪类和碳氢类物质与临沧地区样品相关性较高，吡啶类和含硫化合物与临沧地区样品相关性较高。

（3）HCA的树状图显示4个地区生咖啡豆可以各自聚为一类，4个地区的亲缘距离都较远，这与PCA的分析结果一致。通过对云南不同地区生咖啡豆的挥发性物质分析，建立挥发性物质和地区的相关性，根据挥发性物质的差异为判断指标可以很好地区分云南不同地区咖啡豆，为云南咖啡的风味品质提升及产地追溯提供理论依据。

4 讨论

生咖啡豆中挥发性成分对于烘焙咖啡产品的香气形成至关重要，它们既包括咖啡生长过程中形成的成分，亦受采后加工过程中如脱胶、干燥及贮藏等过程影响。挥发性成分已被广泛用于咖啡豆的地理来源鉴别、品质好坏区分以及脱胶过程中微生物对咖啡质量调控等方面，国内外对于云南不同产区生咖啡豆中挥发性成分的研究还未见报道。张丰等[11]通过HSSMPE/GC-MS对云南3个地区（普洱、保山、临沧）烘焙豆中挥发性物质分析，结果表明，呋喃类物质含量最高，不同地区样品可区分开。董文江等[24]对云南不同地区生咖啡豆风味前体物质研究表明，普洱咖啡中脂肪酸和其他地区均呈显著性差异(P＜0.05)；保山咖啡中氨基酸同其他地区均呈显著性差异；而临沧咖啡中单糖、蛋白质、脂肪和保山咖啡均呈显著性差异。Bertrand等[15]考察了气候和地理环境因素对留尼旺岛阿拉比卡生豆中挥发性成分和咖啡液质量的影响，酸度、果香和风味与低气温环境密切相关，而高气温环境增加醇类物质的积累，海拔高度和平均气温对咖啡质量影响显著。本研究中通过化学计量学方法结合HSSPME/GC-MS可推测中生咖啡豆中与各地区相关性较大的成分。

Lee等[25]通过微生物调控生咖啡豆脱胶过程中发酵过程，改变生豆中挥发性成分及其他反应前体物如脯氨酸和天冬氨酸含量增加1.5倍，阿魏酸和咖啡酸的大量降解导致挥发性风味化合物浓度增加2倍以上。Saw等[26]研究东南亚地区阿拉比卡、利比里亚和罗布斯塔生豆中挥发性成分，3类样品中挥发性成分组成极为相似，均具有较高含量的酚类物质，主要为p-乙烯基愈创木酚和羧酸，同时评价其抗氧化特性。因此，生豆中挥发性成分对咖啡最终产品的质量至关重要，后续研究可进一步通过相关性分析建立云南小粒种生咖啡豆中挥发性成分与烘焙豆杯测得分、电子感官得分及物化指标间的相关性模型，更加客观真实地评价特定产区原料对最终产品风味品质的影响，对于云南地区咖啡豆质量提升和产地追溯具有指导意义。