新疆和田玫瑰花瓣的质量标准初步研究

陈长春 陈嘉媛 庞战 霍仕霞

[摘要] 目的 建立和田玫瑰花瓣药材质量标准，为控制该药材的质量提供实验依据。 方法 参照2015年版《中国药典》通则相关方法，对该药材总灰分、酸不溶性灰分和浸出物进行测定；采用薄层色谱法，以槲皮素为对照，对该药材进行定性鉴别；采用RT-HPLC法，以甲醇-0.1%磷酸（56∶44）为流动相，对玫瑰花瓣中的槲皮素含量进行测定。 结果 该药材薄层鉴别方法具有专属性，总灰分平均为4.9%，酸不溶性灰分平均为0.19%，浸出物为45.8%。槲皮素的含量平均值为0.21%。 结论 根据实验结果初步建立了和田玫瑰花药材的质量标准，所建立的质量标准可用于该产地玫瑰花瓣的质量控制。

[关键词] 玫瑰花瓣；质量标准；槲皮素；鉴别

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（a）-0025-05

[Abstract] Objective To establish a quality standard for rose petals of Hetian， and provide experimental basis for the quality control of the medicinal materials. Methods According to the general principles of Chinese pharmacopoeia in 2015 the total ash content， acid insoluble ash and extract were determined. TLC method was used to identify the crude drug with quercetin as the reference. The content of quercetin in rose petals was determined by RT-HPLC with methanol-0.1% phosphoric acid （56∶44） as the mobile phase. Results The method of TLC had specificity， the total ash was 4.9% in average， the acid insoluble ash was 0.19% in average， and the extract was 45.8% in average. The average content of quercetin was 0.21%. Conclusion According to the experimental results， a quality standard for rose petals is established preliminarily， and the quality standard of the medicinal plants can be used for the quality control of rose petals of Hetian.

[Key words] Rose petals； Quality standard； Quercetin； Identification

玫瑰花瓣在我國已有两千余年的药用历史，是常用的理气药，具有理气解郁、舒肝镇痛、收敛止泻、和血调经等作用，用于肝胃气痛、食少呕恶、月经不调、跌扑伤痛等，尤其是对心血管疾病、各种炎症、肿瘤及糖尿病等具有良好的治疗作用；现代药理学研究表明，玫瑰花瓣还有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化作用，其药用价值已引起国内外医药专家的普遍重视[1-6]。玫瑰花瓣中含有丰富的黄酮类化合物，主要是槲皮素和没食子酸等[7]。目前新疆药材市场供应的玫瑰花瓣为新疆和田地区传统栽培品种，收载于《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》。突厥蔷薇科植物突厥蔷薇（Rosa damascene Mill.）玫瑰花瓣为维吾尔医常用药材，且90%以上的药材都来源于新疆和田地区玫瑰花基地；该产地所产的玫瑰花瓣虽然收载于维吾尔药材标准里，但该标准中仅有关于性状、杂质的记录，目前也未见有关于和田产地的玫瑰花瓣的质量研究。本研究采用传统与现代分析技术相结合的方法，对玫瑰花进行了系统的化学基础研究，对其所含有的黄酮类成分槲皮素进行了研究，建立了槲皮素的含量测定方法，以利于进一步控制其质量，进而为和田玫瑰花瓣的开发利用提供基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪：LC-20AB泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，CBM-20A系统控制器，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，DGU-20A3在线脱气装置，SQP-224-1CN天平（万分之一天平，赛多利斯学仪器有限公司）。DZKW型电热恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 药材与试剂

玫瑰花瓣（经新疆维吾尔自治区维吾尔医医院艾尼瓦尔主任鉴定为和田产玫瑰花瓣，10批玫瑰花瓣批号分别为H30033426、H30033517、H30034618、H30 034719、H30034810、H30034728、H30035411、H300355 19、H30035614、H30035622，均购自和田麦迪森饮片有限公司），甲醇（色谱纯，西格玛奥德里奇贸易有限公司）。槲皮素购自中国食品药品检定研究院（批号：10081-2）。

2 方法与结果

2.1 药材性状及理化鉴定

花或花蕾略呈球形、卵形或不规则团块，直径1.5～2.0 cm。花托壶形或半球形，与花萼基部相连，花托无宿梗或有短宿梗。萼片5枚，披针形，黄绿色至棕绿色，伸展或向外反卷，其内表面（上表面）被细毛，显凸起的中脉。花瓣5片或重瓣，广卵圆形，多皱缩，紫红多线期，少数黄棕色。雄蕊多数。黄褐色，着生于托托周围。体轻，质脆。香气浓郁，味微苦涩。

取本品粗粉2 g，加乙醚20 mL，振摇浸泡1 h，滤过。取滤液2 mL，置蒸发皿中，挥干乙醚，滴加数滴5%香草醛浓硫酸液，滤液即显紫红色。

2.2 薄层色谱鉴别

取本品粉末1 g，加80%甲醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水-乙醚（1∶1）混合溶液6 mL，使溶解，静置分层，弃去乙醚液，水液加乙醚提取2次，每次20 mL，弃去乙醚液，水液加盐酸5 mL，置水浴中水解1 h，取出，迅速冷却，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，用水30 mL洗涤，弃去水液，乙醚液挥干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取槲皮素对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液10 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶 G薄展板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4.5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置紫外光燈（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同频色的荧光斑点，左侧为对照品，右侧为样品。见图1。

2.3 检查与浸出物

①总灰分：取本品细粉4 g，精密称定，置炽灼至恒重的坩埚中，灼烧至灰化，并于500～600℃炽灼至恒重，计算出总灰分。平行进行10个批次的总灰分测定，平均总灰分为4.94%。②酸不溶性灰分：取总灰分项下的残渣，加稀盐酸10 mL，水浴加热10 min，用无灰滤纸滤过，用水洗涤残渣至洗液不显氯化物反应为止，残渣炽灼至恒重，计算出酸不溶性灰分。平行进行10个批次的酸不溶性测定，平均酸不溶性灰分为0.19%。③浸出物测定。取本品4 g，精密加入20%乙醇100 mL，静置1 h，再加热回流1 h，放冷，滤过，精密吸取续滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，蒸干，于105℃干燥3 h，计算出浸出物的量。平行进行10个批次的浸出物测定，平均浸出物为45.92%[8]。

2.4 药材提取及检测结果

2.4.1 色谱条件

色谱条件：YMC-Triart C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇（A）∶水（B）=56∶44，流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，进样量：10 μL，检测波长：374 nm。

2.4.2 对照品溶液制备

精密称取槲皮素对照品适量，制备成浓度为2.02 mg/mL的对照品母液，再加甲醇制成每1 mL含101.0 μg的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备

取玫瑰花瓣细粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定重量，加热回流1.5 h，放冷再称定重量，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，精密加入50%盐酸溶液7 mL，至80℃水浴锅中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，具体方法及结果如下：

2.4.3.1 不同提取方法对槲皮素含量的影响 取玫瑰花瓣细粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，平行6份，精密加入80%甲醇50 mL，称定重量，3份一组，分别采用回流提取法、超声提取法提取1.5 h，放冷再称定重量，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，精密加入50%盐酸溶液7 mL，至85℃水浴锅中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，回流提取药材含量为0.26%，超声提取药材含量为0.26%。由本次HPLC分析结果可知，超声与回流对玫瑰花瓣中槲皮素提取影响相差不大，但超声操作较回流方便易行，故后续实验选择超声提取。

2.4.3.2 不同提取溶剂对槲皮素含量的影响 取玫瑰花瓣细粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，平行9份，3份一组，分别采用甲醇、70%甲醇、70%乙醇50 mL，称定重量后超声1.5 h，放冷再次称定，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，精密加入50%盐酸溶液7 mL，至85℃水浴锅中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，甲醇提取药材含量为0.26%，80%甲醇提取药材含量为0.23%，80%乙醇提取的药材含量为0.24%。由实验结果可知，甲醇提取槲皮素含量优于其他两种提取溶剂，故最佳提取溶剂为甲醇。

2.4.3.3 不同提取时间对槲皮素含量的影响 取玫瑰花瓣细粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，平行9份，3份一组，分别加入甲醇50 mL，称定重量后三组分别超声0.5、1.0、2.0 h，放冷再次称定，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，精密加入50%盐酸溶液7 mL，至85℃水浴锅中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，超声0.5 h药材含量为0.25%，超声1 h药材含量为0.26%，超声1.5 h药材含量为0.25%。由实验结果可知，超声提取时间对玫瑰花瓣中槲皮素的提取影响不是很大，为保证玫瑰花瓣中槲皮素提取完全，选择超声时间为1 h。

2.4.3.4 不同溶剂用量对槲皮素含量的影响 取玫瑰花瓣细粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，平行9份，3份一组，分别加入甲醇30、50、80 mL，称定重量后超声1.0 h，放冷再次称定，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，精密加入50%盐酸溶液7 mL，至85℃水浴锅中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，加入甲醇30 mL药材含量为0.27%，加入甲醇50 mL药材含量为0.26%，加入甲醇80 mL药材含量为0.24%。由实验结果可知，加入甲醇量为30 mL时，即可将槲皮素提取完全，故选择溶剂用量为30 mL。

2.4.3.5 不同盐酸浓度对槲皮素含量的影响 取玫瑰花瓣细粉约20 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称定重量后超声1.0 h，放冷再次称定，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，平行9份，3份一组，每组分别加入等体积7 mL 25%、50%、75%盐酸水溶液水解，至85℃水浴锅中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，加入25%盐酸药材含量为0.27%，加入50%盐酸药材含量为0.26%，加入75%盐酸药材含量为0.25%。由实验结果可知，25%盐酸水解，即可水解完全，故选用25%盐酸水解。

2.4.3.6 不同盐酸用量对槲皮素含量的影响 取玫瑰花瓣细粉约20 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称定重量后超声1.0 h，放冷再次称定，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，平行9份，3份一组，每组分别加入5、7、9 mL，25%盐酸水溶液水解，至85℃水浴鍋中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，加入5 mL盐酸药材含量为0.24%，加入7 mL盐酸药材含量为0.26%，加入9 mL盐酸药材含量为0.22%。由实验结果可知，盐酸用量为7 mL时，药材中的槲皮素含量较高，故后续实验盐酸用量采用7 mL。

2.4.3.7 不同水浴温度对槲皮素含量的影响 取玫瑰花瓣细粉约20 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称定重量后超声1.0 h，放冷再次称定，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，平行9份，3份一组，每组加入7 mL 25%盐酸水溶液水解，三组分别于80℃、85℃、90℃条件下水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，80℃药材含量为0.25%，85℃药材含量为0.24%，90℃药材含量为0.24%。由实验结果可知，水浴温度为80℃时，槲皮素峰面积较水浴温度85、90℃时峰面积大，故后续实验水浴温度采用80℃。

2.4.3.8 不同盐酸水解时间对槲皮素含量的影响 取玫瑰花瓣细粉约20 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称定重量后超声1.0 h，放冷再次称定，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，平行9份，3份一组，每组加入7 mL 25%盐酸水溶液水解，80℃条件下三组分别水解30、60、90 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得，水解30 min药材含量为0.24%，水解60 min药材含量为0.26%，水解90 min药材含量为0.26%。结果表明水解时间增加，水解效果并没有持续增加，水解60 min，即可水解完全[9-23]。

2.5 线性关系比较

精密量取“对照品溶液制备”中对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀。在“色谱条件”色谱条件下进样，以浓度为横坐标，槲皮素峰面积值为纵坐标，槲皮素在5.05～80.80 μg/mL范围内有良好的线性关系。求得回归方程为：y = 39586x + 79783，r = 0.9997。见图2。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.4.2”项下对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积，RSD值为0.16%，结果表明，仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.4.3”项下供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24、48 h时进样10 μL测定，记录峰面积并计算RSD，RSD值为1.32%，表明样品在48 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取同一批样品适量，共6份，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品RSD分别为0.86%（n = 6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率实验

精密取已知含量的样品适量，共9份，分别精密加入质量浓度为2.02 mg/mL的槲皮素对照品母液1、1.25、1.5 mL，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。见表1。

2.10 样品含量测定

对下列10个不同批号和厂家的玫瑰花瓣分别按照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4.1”项色谱条件，测定样品中槲皮素的含量[24-25]。见表2。

3 讨论

供试品溶液的制备研究中，根据槲皮素的理化性质，对供试品的提取方法（超声、回流）、提取溶剂（甲醇、80%甲醇、80%乙醇）、溶剂用量（30、50、80 mL）、提取时间（0.5、1、1.5 h）、盐酸浓度（25%、50%、75%）和盐酸用量（5、7、9 mL）进行了考察和分析，以槲皮素的含量为考察指标，确定了文中测定玫瑰花瓣中槲皮素的供试品溶液制备方法，提示该提取方法可行。

本研究采用甲醇（A）∶水（B）=56∶44，流速：1.0 mL/min，柱温：30℃的色谱条件，由本研究结果可看出，经过酸解的玫瑰花瓣提取物中槲皮素含量高于未水解样，水解后的提取物中黄酮苷类苷元主要为槲皮素，这对玫瑰花瓣中黄酮醇苷含量测定方法的建立有参考价值。因此本研究仅以槲皮素为对照品对玫瑰花瓣提取物进行测定，其他成分由于缺乏相应对照品仍不能准确定性与定量。

总之，本研究所建立的测定方法排除了玫瑰花瓣中所含色素和其他多酚物质产生的干扰，简便、准确、快速，且方法学考察表明，精密度、检测限、加样回收率的范围均符合要求，为和田地区玫瑰花瓣质量控制提供了准确可行的依据。通过对10批和田产地的玫瑰花瓣（采收期一致）进行含量测定，结果表明固定采收期后，和田玫瑰花瓣中有效成分槲皮素的含量差异较小，可作为含玫瑰花瓣药材的药物开发的可持续利用资源。

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