CD151对结肠癌中Wnt信号通路变化的影响

刘学刚 刘艳彩 吴春平 李景光 赵岭岭 张振亚

[摘要] 目的 探究CD151对结肠癌中Wnt信号通路变化的影响。 方法 采用Western blot方法分别检测正常结肠癌细胞（HT29）、CD151基因敲除的结肠癌细胞（CD151--HT29）中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表达情况；采用实时定量PCR技术分别检测HT29、CD151--HT29细胞中LRG-1以及LGR-5基因的表达情况；考察HT29、CD151--HT29细胞的侵袭能力。 结果 HT29细胞中存在明显的CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白表达，而CD151--HT29细胞中并无CD151蛋白的表达，且可以观察到LRG-1以及LGR-5蛋白表达量明显下降；实时定量PCR结果显示，与HT29细胞比较，CD151--HT29细胞中的LRG-1以及LGR-5基因表达显著下降（P < 0.05）；细胞侵袭实验可见，HT29细胞侵袭能力强于CD151--HT29细胞（P < 0.05）。 结论 CD151基因的缺失能够抑制Wnt信号通路的起始蛋白LRG-1、LGR-5的表达，并且能够下调癌细胞侵袭能力，提示CD151基因对Wnt信号通路存在一定调控作用，这为结肠癌联合靶向治疗提供了一定的科学指导。

[关键词] CD151；结肠癌；Wnt信号通路

[中图分类号] R735.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（a）-0013-04

[Abstract] Objective To explore the effect of CD151 on the changes of Wnt signaling pathway in colon cancer. Methods Western blot method was used to detect colon cancer cells （HT29） and CD151 gene knockout colon cancer cells （CD151--HT29） in CD151， LRG-1 and LGR-5 protein expression； the expression of LRG-1 HT29， CD151--HT29 cells and LGR-5 gene were detected by real-time quantitative PCR technique； the invasion ability of HT29， CD151--HT29 cells was inspected. Results The results showed that there was CD151， LRG-1 and LGR-5 protein expression in HT29 cells， but no CD151 protein expression in CD151--HT29 cells， and significantly decrease could be observed in the expression of LRG-1 and LGR-5 protein； real-time quantitative PCR results showe that， compared with HT29 cells， the expression of LRG-1 and LGR-5 gene in CD151--HT29 cells decreased significantly （P < 0.05）. Cell invasion assay showed that HT29 cell invasion ability was stronger than that in CD151--HT29 cells （P < 0.05）. Conclusion The expression of CD151 gene deletion can inhibit Wnt signaling initiation protein LRG-1 and LGR-5， and decrease the cancer cell invasion， which indicates that the CD151 gene has some role in the regulation of Wnt signaling pathway， to provide some scientific guidance for the colorectal cancer combined with targeted therapy.

[Key words] CD151； Colorectal cancer； Wnt signaling pathway

結肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，尽管我们已经在结肠癌的发生与发展上取得了重大突破，但是对于晚期的肿瘤转移仍然束手无策，而肿瘤转移恰恰正是结肠癌复发率高、治愈率低的主要原因[1-2]。众所周知肿瘤转移是一个复杂的、多步骤的过程，目前可以确定的是，肿瘤转移与肿瘤内部的肿瘤干细胞存在密切联系[3]，而Wnt信号转导通路是肿瘤干细胞实现自我更新以及分化功能的重要信号通路[4]，其中LRG-1和LGR-5蛋白是Wnt信号转导通路的重要参与组成，均能够促进肿瘤血管的生成，并参与多种肿瘤细胞的转移[5-6]。研究发现，CD151作为TM4SF家族中唯一的癌基因，在肿瘤血管内皮细胞中大量表达，具有稳定新生血管的能力[7]。为探究CD151对结肠癌中Wnt信号通路的变化影响，本研究分别比较人结肠癌细胞（HT29）、敲除CD151基因的HT29细胞（CD151--HT29）中Wnt信号转导通路靶基因CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表达情况，LRG-1和LGR-5基因转录情况，以及两种细胞的侵袭能力，以期为临床上联合靶向治疗结肠癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

本实验主要涉及Western blot、实时定量PCR以及细胞侵袭四大部分实验，主要试剂如下：DEME培养基（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司）；BCA蛋白分析试剂盒（Thermo公司）；LRG-1、LGR-5、β-acting抗体（美国Abcam公司）；荧光二抗（华拓生物科技股份有限公司）；Trizol裂解液（美国invitrogen公司）；Matrigel胶（美国Becton-dickinson公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将HT29、CD151--HT29放入细胞培养瓶中培养，以含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行细胞培养，采用倒置显微镜观察细胞生长状态。待细胞长满时进行细胞传代，将培养瓶中的培养基除去，使用PBS溶液清洗2～3次，再加入1 mL胰酶进行细胞消化5 min后，加入培养基稀释胰酶停止消化，使用吹打管吹打培养基将培养瓶壁上的细胞吹打至培养基中，转移至15 mL离心管内离心5 min后，将含有胰酶的培养基导入废液缸内，重新导入培养基，用吹打管将细胞吹打均匀，转移至培养瓶中。取正处于生长期的细胞备用。

1.2.2 Western blot技术 待细胞培养瓶内的细胞长满约80%时，将培养瓶中培养基倒入废液缸内，使用PBS溶液清洗2～3次放于冰上，加入4 mL细胞裂解液（内含100 μL PMSF/mL），摇匀，放置在冰上裂解30 min后，用细胞刮将细胞轻轻刮下，将细胞裂解液与细胞碎片转移至离心管中，12 000 r/min离心5 min后取上清，使用BCA定量试剂盒测定上清液中所含蛋白浓度，确定并统一SDS-PAGE凝胶电泳上样量。

取30 μg样品蛋白与5倍体积的缓冲溶液混合煮沸10 min，上样，80 V恒温电压跑胶3～4 h。电泳结束后交分离胶小心取下，放入置转膜液中进行转膜。使用ECL发光试剂盒滴加到转好膜的PVDF膜上，作用5 min后用滤纸吸掉多余发光试剂，在暗室中根据PVDF膜的大小裁剪出适当大小的X线感光胶片进行曝光。将曝光后的胶片放入凝胶成像分析系统中进行分析，使用Quantity One图像分析软件分析目标条带的分子量和光密度值。

1.2.3 实时定量PCR技术 分别将处于对数生长期的HT29、CD151--HT29细胞，加入1 mL Trizol，待细胞裂解后收集至1.5 mL Ep管中，混匀，离心，取上清液置入新的Ep管内，加入200 μL氯仿，摇匀，静置15 min后，离心，小心取出上层水相，加入等体积的异丙醇，摇匀，可以隐约看到有白色絮狀RNA出现，离心，弃去上清，保留白色沉淀，将提取出来的总RNA逆转录生成cDNA文库。根据NCBI Gene Bank内提供的基因序列，LRG-1和LGR-5上下游引物序列如表1所示。将引物用ddH2O溶解，配成终浓度为10 pmol/μL，于-20℃冻存，备用。各引物均取出2.0 μL，加入至PCR体系：3.0 μL cDNA，5.0 μL 5×PCR Buffer，0.5 μL MgCl2，2.0 μL上游引物，2.0 μL下游引物，12.3 μL ddH2O，总体积为25 μL，进行PCR反应。于94℃预变性4 min，94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸60 s，40个循环扩增。扩增后PCR产物立即进行电泳，最终用2-△△CT法计算目的基因的表达量。

1.2.4 细胞侵袭实验 将Matrigel胶用同样体积的不完全培养基稀释后，加入至细胞小室中摇晃，使Matrigel胶平铺在细胞小室底部，37℃成胶30 min。将准备好的细胞小室放入至24孔培养板中，分别在小室内加入含有1×105个HT29、CD151--HT29细胞，再在小室外加入600 μL培养基，常规培养24 h后取出细胞小室，弃去小室外培养基，使用生理盐水以及棉签小心擦去Matrigel胶，在倒置显微镜下观察侵袭细胞数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种肿瘤细胞中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表达情况

采用Western blot方法分别检测HT29、CD151--HT29细胞中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表达情况，结果显示，在HT29细胞中CD151存在明显表达，而在CD151--HT29细胞中未检测出CD151蛋白，在HT29细胞中LRG1与参比蛋白β-actin的比值为（0.11±0.02），显著高于CD151--HT29细胞中的LRG1与参比蛋白β-actin的比值（0.06±0.02）（t = 3.995，P = 0.016）；在HT29细胞中LGR5与参比蛋白β-actin的比值为（0.13±0.03），显著高于CD151--HT29细胞中的LGR5与参比蛋白β-actin的比值（0.06±0.02）（t = 3.834，P = 0.019）。见图1。

2.2 两种肿瘤细胞中LRG-1和LGR-5基因转录情况

采用实时定量PCR技术分别检测HT29和CD151--HT29细胞中LRG-1以及LGR-5基因的转录水平，结果显示HT29细胞中LRG-1基因的转录水平为（1.00±0.02），CD151--HT29细胞中LRG-1基因的转录水平为（0.55±0.01），HT29细胞LRG-1基因的转录水平显著高于CD151--HT29细胞（t = 42.375，P = 0.000）；HT29细胞中LGR-5基因的转录水平为（1.00±0.02）、CD151--HT29细胞中LGR-5基因的转录水平为（0.62±0.02），HT29细胞LGR-5基因的转录水平显著高于CD151--HT29细胞（t = 31.002，P = 0.000）。见图2。

2.3 两种肿瘤细胞侵袭能力

采用构建细胞小室的方法检测HT29、CD151--HT29细胞的侵袭能力，结果显示常规培养24 h后，HT29细胞侵袭人工基底滤膜的细胞数（246.33±21.55）明显多于CD151--HT29细胞（97.67±14.01），差异有统计学意义（t = 10.018，P < 0.001）。见图3。

3 讨论

近年来，随着我国人民生活水平的提高以及飲食、环境的变化，我国结肠癌发病率正在逐年升高。传统的手术治疗以及化学、放射疗法并不能发挥理想的治疗效果，治疗后仍然存在癌症高转移率以及高复发率，目前现有的科学研究水平尚不能完全解释肿瘤转移机制[8]。早期的研究表明，CD151能够通过维持血管上皮细胞-细胞和细胞-基质之间的正常黏附，从而维持新生血管的稳定性以及通透性，是病理性血管形成的必要条件[9-10]。为了能够更好地探究CD151调控肿瘤转移的机制，有学者将目光转向Wnt信号转导通路。Wnt信号转导通路的激活也是肿瘤转移的必要条件之一[11]，而CD151与Wnt信号转导通路之间的关系尚少见报道。本研究通过比较HT29和CD151--HT29两种细胞中Wnt信号转导通路相关基因的转录与翻译情况，探究CD151对Wnt信号转导通路的调控。

CD151是一种膜蛋白，广泛分布于各种细胞表面，结构上具有两个细胞外环、两个细胞内末端（-COOH/-NH2）的特征，这些特征赋予了CD151能够与细胞表面多种蛋白质结合的能力，因此CD151在众多生理活动过程中扮演着十分重要的角色[12-13]，研究表明，CD151蛋白高表达的癌症患者的存活率显著低于CD151蛋白表达低的癌症患者[14]，证明了CD151蛋白在癌症的发生、发展以及转移过程中也发挥着重要的作用。CD151主要是通过与整合素形成稳定的复合体，调节细胞吸附以及迁移能力[15]。本研究结果显示，CD151--HT29细胞中的LRG-1和LGR-5基因无论是转录阶段还是在翻译阶段均受到抑制，发生下调，并且缺失CD151基因的癌症细胞的细胞侵袭能力减弱。

LRG-1蛋白LGR-5蛋白均是Wnt信号通路的靶蛋白，其中LRG-1蛋白能够促进肿瘤血管的生成，在正常组织中却少有表达[16]，能够促进肿瘤细胞的表达；LGR-5蛋白是肿瘤干细胞标志物，能够促进血管内皮生长因子（VEGF）的表达，研究表明，VEGF能够促进肿瘤血管的生成，增强肿瘤血管通透性，促进肿瘤淋巴管的生长，以及增强肿瘤细胞对放化疗的耐受性，并且VEGF在肿瘤侵袭转移中发挥着重要的作用[17-18]。LGR-5主要是与Wnt信号通路的起始蛋白Wnt蛋白结合，发挥激活Wnt信号通路的作用，使得Wnt信号通路的核心蛋白β-catenin蛋白在细胞内的积聚，当LGR-5正常表达时，β-catenin蛋白的生成与降解同时存在，β-catenin蛋白浓度维持在一个较低水平，目前多项研究表明在结肠癌细胞中β-catenin蛋白表达量显著上升[19-20]。

综上所述，CD151很可能是Wnt信号通路上游调控因子，通过调节Wnt信号通路相关基因的表达，从而影响肿瘤的发生、发展及转移，这很可能会为临床上治疗结肠癌提供一个新的突破点。

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