邹湘渝 曾琴 刘萍
【摘要】 目的:探讨黏着斑激酶(focal adhesion kinase ,FAK)抑制剂TAE226对人舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)细胞株Tca8113中波形蛋白(Vimentin)的表达是否有抑制作用及其意义。方法:FAK抑制剂TAE226作用于Tca8113细胞,分别培养24 h、48 h、72 h,采用实时荧光定量PCR技术检测Vimentin mRNA的表达情况。结果:与对照组比较,Vimentin mRNA的相对表达量均显著下降,实验组与对照组在各个时间点上Vimentin mRNA的表达差异均有统计学意义(P <0.05),并呈现出剂量-效应依赖性与时间-效应依赖性(P<0.05)。当TAE226作用72 h时,0.5 μmol /L组、1 μmol/L组、5 μmol/L组和10μ mol/L组的Vimentin mRNA的相对表达量分别是对照组的0.51倍、0.41倍、倍、0.24倍和0.12倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TAE226可以抑制舌鳞癌细胞株Tca8113中Vimentin的表达,这可能在TAE226抑制人舌鳞癌细胞侵袭和转移过程中扮演重要角色。
【关键词】 TAE226; 黏着斑激酶; 舌鳞状细胞癌; 波形蛋白
doi:10.14033/j.cnki.cfmr.2018.18.004 文献标识码 A 文章编号 1674-6805(2018)18-000-03
The Expression of Vimentin in Human Tongue Squamous Cell Carcinoma Cells Acted by Focal Adhesion Kinase Inhibitor TAE226/ZOU Xiangyu,ZENG Qin,LIU Ping,et al.//Chinese and Foreign Medical Research,2018,16(18):-11
【Abstract】 Objective:To study whether TAE226(a focal adhesion kinase inhibitor) could inhibit the expression of Vimentin in human tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 and its significance.Method:Tca8113 cells were cultured with TAE226.On hour 24,48,72,RT-PCR was conducted to detect the expression of Vimentin.Result:Compared to the control group,the expression level of Vimentin in the experimental groups decreased(P<0.05).The relative expression differences of the experimental groups and control groups at all time points showed statistically significant(P<0.05).When TAE226 worked 72 h,the relative expressions of Vimentin in 0.5 μmol/L group,1 μmol/L group,5 μmol/L group and 10 μmol /L group had dropped 0.51 times,0.41 times,0.24 times and 0.12 times respectively(P<0.05).Conclusion:TAE226 can effectively inhibit the expression of Vimentin in human tongue cell line Tca8113,which may play an important role in the invasion and metastasis of TAE226 inhibiting human tongue squamous cell carcinoma.
【Key words】 TAE226; Focal adhesion kinase; Tongue squamous cell carcinoma; Vimentin
First-authors address:The Hospital of Stomatology Southwest Medical University,Luzhou 646000,China
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC,简称口腔鳞癌)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,同时也是世界第六常见的恶性肿瘤,是世界范围内癌症发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。局部浸润和远处转移是OSCC难治性与致死性的根本原因,因此阻断癌前病变突破基底膜转化为浸润癌(即侵袭生长),是实现口腔鳞癌早期防治的关键。TAE226是一种二苯胺基吡啶化合物,是目前公认的针对黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的ATP競争性酪氨酸激酶抑制剂,可以有效阻断FAK信号通路。随着研究的深入,人们发现TAE226能抑制口腔癌、卵巢癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、人神经母细胞瘤等多种恶性肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力及血管生成[2-3]。本实验通过定量RT-PCR法检测TAE226作用于人舌鳞癌Tca8113细胞后波形蛋白(vimentin) mRNA的表达变化并探讨其意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
Tca8113细胞株,西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室提供;TAE226,Selleck 上海蓝木化工有限公司;优质胎牛血清,北京索莱宝生物科技有限公司;RPMI1640培养液,赛默飞世尔生物化学制品有限公司;PBS,北京索莱宝生物科技有限公司;DMSO,美国AMRESCO;RNA提取试剂盒,TIANGEN生化科技有限公司;逆转录试剂,日本TOYOBO公司;QuantiFast ?SRBR? Green PCR Kit,德国QIAGEN公司。
1.2 实验方法
1.2.1 TAE226的配制及实验分组 将TAE226溶解于DMSO 20 mmol/L(在Z-VAD-FMK试管中加入107 μl的DMSO,稀释成20 mmol/L液体),于-20 ℃冰箱中分装保存。临用前按比例稀释。本实验将配制成TAE226终浓度为0.5、1、5、10 μmol/L的培养液作为实验组,配制含相同体积比例的DMSO的培养液为对照组。
1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测 Tca8113细胞株由含10%胎牛血清、青霉素100 μg/ml、链霉素100μg/ml及RPMI-1640培养基配制的培养液于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。Tca8113细胞按5×105/ml的密度接种于六孔板,待细胞完全贴壁后,去除废液,PBS冲洗,并分别加入TAE226(0、0.5、1、5、10μmol/L)的培养液3 ml/孔,摇匀,置于孵箱中培养。分别在培养24、48、72 h后,按试剂盒说明书裂解细胞提取总RNA,并于微量分光光度计上检测RNA纯度及浓度,逆转录合成cDNA并扩增Vimentin RNA。反应体系:总RNA模板2 ?l
(1 ?g),蒸馏水6.4 μl,?SRBR? Green Real time PCR Master Mix 10 ?l,上游引物0.8 μl,下游引物0.8 μl。设置三个复孔,扩增条件为:95 ℃预变性,30 s;95 ℃变性30 s;57 ℃退火10 s;72 ℃延伸15 s,共40个循环。RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成,见表1。以目的基因的相对表达量=2-ΔΔCT计算出各基因的相对表达水平,其中ΔCt=CT(目的基因)-CT(内参基因),ΔΔCt=ΔCT(实验组)-ΔCT(对照组)。上述实验重复三次。
1.3 统计学处理
实验结果采用SPSS 17.0统计学软件分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用重复变量方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
与对照组比较,加入TAE226后,Vimentin mRNA的相对表达量都显著下降,实验组与对照组在各个时间点上mRNA的表达差异均有统计学意义(P<0.05),呈现出剂量-效应依赖性与时间-效应依赖性(P<0.05)。取各对照组Vimentin mRNA的相对表达量为1,则10 μmol/L组mRNA的表达均低于5 μmol/L组、1 μmol/L组、0.5 μmol /L组(P<0.05),且72 h 10μmol/L组的Vimentin mRNA较对照组下降了约0.12倍(P<0.05),见图1和表2。
3 讨论
口腔鳞状细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,而舌鳞状细胞癌,简称舌鳞癌又是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤[4],其生物学行为恶劣,早期即可发生淋巴结转移,严重威胁着人类健康[5]。肿瘤转移为受多种促转移基因和转移抑制基因调控的复杂过程,其中肿瘤细胞侵袭是肿瘤转移的前提,有必要对其相关分子机制进行深入研究。FAK是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶,是细胞内重要的骨架蛋白与多种信号通路的关键分子。它在整合生长和细胞基质黏附信号方面具有关键作用,是癌症侵袭和转移的主要驱动力[6-7]。相关研究发现,FAK在口腔鳞癌中高表达,且与口腔鳞癌的侵袭能力呈正相关关系,目前已成为研究抗肿瘤药物的重要靶点之一。而TAE226是目前发现的一种针对FAK的强效抑制剂[7]。Kurio等[8]研究发现TAE226可抑制人类口腔鳞状细胞癌SAS细胞的增殖、迁移和侵袭,且经TAE226处理后的口腔鳞癌细胞伴有肌动蛋白纤维和细胞黏附丧失。Vimentin是一种进化上保守的中间纤维蛋白,人类波形蛋白的编码基因位于染色体10p13,作为一种重要的骨架蛋白维持细胞的完整性,与细胞骨架构成和细胞黏附密切相关。波形蛋白是间质细胞的标志物,主要表达于间充质,在正常上皮组织中并不表达[9]。但近年研究发现波形蛋白在上皮来源的肿瘤如乳腺癌、肝癌、肾上腺癌、胃癌、直肠癌、宫颈癌等中异常表达,并参与肿瘤的侵袭和转移过程[10],因此通过分子生物学的方法阻止肿瘤中波形蛋白的过表达降低肿瘤的侵袭性,从而为肿瘤的分子靶向治疗开辟了一条新道路。
本课题组前期研究中发现,1μmol/L TAE226对Tca8113细胞的增殖、迁移、侵袭已有明显的抑制效果,在本实验中,TAE226作用下的人舌鳞癌Tca8113细胞中间质标志物Vimentin mRNA表达下降,且TAE226剂量越大,作用时间越长,Vimentin mRNA的相对表达量则越低,TAE226抑制了人舌鳞癌细胞中Vimentin的表达。有研究发现,肿瘤在侵袭转移的过程中,Vimentin可表达在上皮源性的肿瘤细胞的胞質内,赋予了上皮源性细胞成纤维细胞样的特征,使细胞更易于迁移和运动,细胞之间黏附连接能力下降,迁移、侵袭和转移能力增强,发生上皮-间质转变(EMT),后者是癌变侵袭转移的首要步骤,严重影响病变的预后,因此Vimentin已经成为上皮源性肿瘤预后的重要指标[11-12]。因此,可以推测TAE226抑制Vimentin的表达,降低细胞迁移和运动能力,增强细胞的黏附能力,进而抑制细胞的侵袭和转移。
綜上所述,TAE226,作为FAK的强效抑制剂之一,能抑制人舌鳞癌细胞中Vimentin的表达,这可能在TAE226抑制舌鳞癌细胞的迁移、侵袭和转移过程中起着重要作用。由于肿瘤侵袭转移的机制十分复杂,本课题组将在波形蛋白及EMT信号通路方面进一步实验研究以探讨TAE226的抗肿瘤机制,为进一步探索口腔肿瘤的防治策略提供参考。
参考文献
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(收稿日期:2018-01-19)