护肾(Ⅲ)号胶囊中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1在大鼠体内药代动力学研究

2018-09-25 04:43钱伟冯星月陈晓峰王建平蒋志涛余辉
中国中医药信息杂志 2018年7期
关键词:药代动力学

钱伟 冯星月 陈晓峰 王建平 蒋志涛 余辉

摘要:目的 建立超高液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)测定护肾(Ⅲ)号胶囊给药后大鼠血浆中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1含量的方法,并对其药代动力学特征进行研究。方法 SD大鼠灌胃护肾(Ⅲ)号胶囊2 g/kg后按时间点取血,以地高辛为内标,采用UHPLC-MS/MS测定给药不同时点血浆中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1浓度,并用DAS2.0软件计算药代动力学参数。结果 三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的线性关系良好(r≥0.997 5);日内、日间精密度RSD均小于13.1%,准确度、回收率及稳定性符合生物样品分析要求。大鼠体内三七皂苷R1药代动力学参数:T1/2(7.86±1.69)h,Tmax(4.00±1.04)h,Cmax(0.23±0.05)mg/L;人参皂苷Rg1药代动力学参数:T1/2(4.58±0.95)h,Tmax(6.00±0.00)h,Cmax(0.32±0.03)mg/L。结论 本研究建立的UHPLC-MS/MS分析方法灵敏、准确可靠,适用于护肾(Ⅲ)号胶囊的药代动力学研究。

关键词:护肾(Ⅲ)号胶囊;超高液相色谱串联质谱;药代动力学

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.017

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)07-0071-04

Abstract: Objective To establish a UHPLC-MS/MS method for the determination of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 in rat plasma after oral administration of Hushen (Ⅲ) Capsules; To study its pharmacokinetics. Methods SD rats were given Hushen (Ⅲ) Capsules 2 g/kg and then the blood was collected at time point. Digoxin was used as internal standard. The drug concentrations of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 in plasma were determined by UHPLC-MS/MS. And the relative pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS2.0 software. Results The linear relationship of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 was good (r≥0.997 5). The RSD of intra-day and inter-day precision were less than 13.1%. The results of accuracy, recovery and stability met the requirements for the biology sample analysis. For notoginsenoside R1, the pharmacokinetics parameters T1/2, Tmax, Cmax in the plasma were (7.86±1.69)h, (4.00±1.04)h, (0.23±0.05)mg/L. For ginsenoside Rg1, the pharmacokinetics parameters T1/2, Tmax, Cmax in plasma were (4.58±0.95)h, (6.00±0.00)h, (0.32±0.03)mg/L. Conclusion The established UHPLC-MS/MS method is sensitive, accurate and reliable, and is suitable for the pharmacokinetic study of Hushen (Ⅲ) Capsules.

Keywords: Hushen (Ⅲ) Capsules; UHPLC-MS/MS; pharmacokinetics

目前,血尿形成機制尚未完全阐明,通常认为与免疫炎症反应导致肾小球基底膜受损有关,西医治疗往往效果不佳,迁延难愈。肾性血尿属中医学“血证”范畴,中医治疗血尿积累了丰富的临床经验,并取得了较好的疗效[1]。护肾(Ⅲ)号胶囊是张家港市中医医院复方制剂,由白茅根、三七、大黄炭组成,具有清热解毒、滋肾降火功效,临床常用于治疗血尿为主的各种肾病。三七作为方中臣药,具有良好的止血、活血化瘀、消肿止痛作用,辅助君药白茅根治疗血尿诸症。三七总皂苷为三七的主要有效成分,具有抗炎、增强免疫功能的作用。已有研究采用HPLC对护肾(Ⅲ)号胶囊的有效成分进行了含量测定[2]。本研究采用高效、灵敏的超高液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)技术对护肾(Ⅲ)号胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1在血浆中的含量进行分析,并对其在大鼠血浆中的药动学特征进行研究,为进一步开展护肾(Ⅲ)号胶囊临床应用研究,明确其作用机制奠定基础。

1 仪器、试药与动物

Agilent 1290超高效液相色谱仪;Agilent 6430 LC-MS三重四级杆质谱仪,配有电喷雾化离子源(ESI),MassHunter色谱工作站;AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司);MICRO-17R冷冻离心机(美国Thermo公司);WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);Drict-Q5超纯水机(法国Millipore公司)。

三七皂苷R1对照品(纯度94%,批号110745- 201318)、人参皂苷Rg1对照品(纯度95%,批号110703-201529)、地高辛对照品(纯度99%,批号100015-201308),中国食品药品检定研究院;护肾(Ⅲ)号胶囊(批号170227),张家港市中医医院制剂室。

SPF级健康雄性SD大鼠8只,体质量(240±20)g,南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供,合格证号SCXK(沪)2013-0006。饲养环境温度20~25 ℃,相对湿度50%~60%,自然光照。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱检测条件

色谱柱:Agilent ZOBAX SB C18柱(2.1 mm×150 mm,5 ?m);流动相:甲醇-0.1%甲酸水溶液(75∶25);流速:200 ?L/min;柱温:35 ℃;进样量:2 ?L。离子源:ESI;离子化模式:正离子;定量模式:多反应监测模式(MRM);毛细管电压:4000 V;干燥气温度:400 ℃;Fragmentor及CE值:三七皂苷R1分别为300、40 V,人参皂苷Rg1分别为260、40 V,地高辛(内标)分别为270、50 V;检测对象:三七皂苷R1 m/z 955.5→m/z 775.5;人参皂苷Rg1 m/z 823.5→m/z 643.5;内标m/z 803.6→m/z 283.1。各化合物质谱参数见表1。

2.2 对照品溶液与内标溶液的配制

精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1对照品适量,用甲醇溶解于10 mL容量瓶中,制成三七皂苷R1、人参皂苷Rg1浓度分别为1.01、1.036 mg/mL的混合对照品贮备液。取上述贮备液,用甲醇稀释,制成不同浓度的对照品溶液,用于考察线性关系。精密称取地高辛对照品适量,加甲醇配制成浓度为2 ?g/mL的内标溶液。对照品溶液与内标溶液均在4 ℃条件下贮藏。

2.3 给药与样品采集

SD大鼠8只,适应性饲养1周。实验前禁食12 h,自由饮水,按2 g/kg剂量灌胃给予护肾(Ⅲ)号胶囊(用0.5%CMC-Na溶解),分别于给药后0.083、0.25、0.5、0.75、2、4、6、8、12、24、48 h经大鼠眼眶静脉丛采血约0.2 mL,置于放有肝素钠的离心管中,4000 r/min离心10 min,吸取血浆,放入-20 ℃冰箱冷冻保存。采用DAS2.0软件对所测血药浓度-时间数据进行处理。

2.4 血浆样品的处理与分析

精密吸取血浆样品50 ?L,置2 mL离心管中,精密加入内标溶液10 ?L,涡旋混匀30 s,加乙腈-甲醇(1∶1)混合溶剂500 ?L,沉淀蛋白,涡旋3 min,12 000 r/min离心10 min,吸取上清液,于37 ℃水浴中以氮气流吹干,残留物加甲醇-水(50∶50)溶剂100 ?L复溶,涡旋混匀3 min后,12 000 r/min离心10 min,取上清液2 ?L,进行UHPLC-MS/MS分析。按标准曲线法,根据峰面积比值计算血浆样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1的浓度。

2.5 方法学验证

基质特异性、灵敏度、线性、准确度、精密度、回收率、基质效应和稳定性均按2015年版《中华人民共和国药典》关于“生物样品定量分析方法验证指导原则”进行[3-4]。

2.5.1 专属性考察

取大鼠空白血浆样品、空白血浆加混合对照品及内标溶液、大鼠给药后血浆样品适量,按“2.4”项下方法进行处理分析,进样测定,得到空白血浆、空白血浆+混合对照品、大鼠给药后1 h血浆样品中各待测成分的提取离子流图,见图1。结果显示,护肾(Ⅲ)号胶囊中2种待测成分能与内标物完全分离,峰形良好,空白血浆在相应时间处没有出峰,无明显杂质和内源性物质的干扰,表明该血浆处理方法及测定条件专属性良好。

2.5.2 线性关系考察

在空白大鼠血浆中加入按“2.2”项下方法配制的系列对照品溶液,按“2.4”项下方法操作后进样检测,以待测物与内标的峰面积比值为纵坐标,待测物浓度为横坐标,采用加权(1/x2)最小二乘法进行线性回归分析,求得各成分的回归方程、相关系数及线性范围,根据信噪比(S/N)>10计算各成分的最低定量限,结果见表2。

2.5.3 精密度和准确度

取空白大鼠血浆,加入混合对照品溶液和内标溶液,配制成三七皂苷R1(2、4、96、384 ng/mL)和人参皂苷Rg1(1、2、48、192 ng/mL)最低定量限和低、中、高3个浓度的质量控制(QC)样品(n=6),按“2.4”项下方法进行操作,连续测定3 d。计算2种成分的日内RSD均小于11.2%、日间RSD均小于13.1%,准确度均在93.8%~103.6%范围内,提示该方法准确、可靠、重现性好。

2.5.4 提取回收率与基质效应

取空白大鼠血浆100 ?L数份,按“2.4”项下方法分别制备低、中、高3个浓度三七皂苷R1、人参皂苷Rg1的QC样品各6份,采用UHPLC-MS/MS方法分析,测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及内标的峰面积为A。另取空白大鼠血漿100 ?L数份,按“2.4”项下方法,蛋白沉淀离心后上清液中加入对应浓度的混合对照品溶液和内标溶液,同法操作,得峰面积B。另取上述与QC样品浓度相同的混合对照品溶液和内标溶液,按“2.4”项下“氮气流吹干”后方法操作,得峰面积C。A与B的比值为提取回收率,B与C的比值为基质效应,结果见表3。提取回收率范围为92.5%~101.4%,基质效应范围为91.5%~106.2%,均符合要求。

2.5.5 药代动力学研究

血浆样品按“2.4”项下方法进行处理,按“2.1”项下条件进行测定,记录峰面积并代入回归方程,计算各时间点三七皂苷R1、人参皂苷Rg1的血药浓度,绘制平均血药浓度-时间曲线,见图2。采用DAS2.0软件计算药代动力学参数并对药物在大鼠体内的动力学过程进行拟合,结果表明,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1在大鼠体内代谢符合二室模型,其相关药动学参数见表4。

大鼠灌胃护肾(Ⅲ)号胶囊后,药代动力学研究结果表明,2种成分经体内吸收后达峰时间接近,三七皂苷R1在体内吸收情况较人参皂苷Rg1为优(AUC值较大)。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1在大鼠体内的平均滞留时间(MRT0-48)均较长,分别为(5.12±1.26)h、(7.11±1.03)h,生物利用度高,可充分发挥药效。

3 讨论

本试验比较了不同流动相洗脱体系,包括乙腈-水梯度洗脱[5-6]、乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱[7]、乙腈- 20 mmol/L NaH2PO4(24∶76)[8]、甲醇-0.2 mol/L乙酸铵-冰醋酸(63∶37∶1)[9]及甲醇-0.1%甲酸水(75∶25),结果表明,所选流动相均能获得较好的色谱峰形,考虑到流动相组成简单、操作方便,并且试验后色谱柱容易清洗,更好保护色谱柱,最终选择甲醇- 0.1%甲酸水(75∶25)为流动相。

药物进入动物体内后,经过吸收、分布、代谢,最后排出体外,在血浆样品中除了含有原型待测药物外,也含有待测药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物及内源性物质等,因此需要对血浆样品进行前处理后测定血浆样品中的待测药物。本试验考察了不同溶剂乙腈[10]、甲醇[11]、丙酮-甲醇(4∶1)[12]和乙腈-甲醇(1∶1)[13]沉淀血浆中蛋白的效果,结果表明,经乙腈-甲醇(1∶1)处理的血浆样品基质效应较小,灵敏度更高,峰形良好,因此选用此法处理血浆样品。

本研究采用UHPLC-MS/MS对SD大鼠灌胃护肾(Ⅲ)号胶囊后三七皂苷R1、人参皂苷Rg1的药代动力学进行研究,建立了准确、快速、灵敏的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1在大鼠体内血药浓度的测定方法,明确了皂苷成分体内暴露程度及消除半衰期,进一步揭示了护肾(Ⅲ)号胶囊治疗血尿诸证的药效物质基础,有望较好地应用于临床,为后期的物质基础及作用机制研究提供可靠的保障。

参考文献:

[1] 王惠玲,司海龙,高建东.中医药治疗肾性血尿的研究进展[J].四川中医,2015,33(3):189-191.

[2] 陈燕,陈霞.HPLC法同时测定护肾胶囊(Ⅲ)中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量[J].現代中药研究与实践,2014,28(5):72-75.

[3] 马浩玲,张德芹,丁丽琴,等.HPLC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中山楂叶提取物3种黄酮类成分及其药代动力学研究[J].天津中医药,2017, 34(4):266-271.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:363-368.

[5] 李丽明,刘若轩,郭洁文,等.三七皂苷R1在急性心肌缺血大鼠体内的药动学研究[J].中药材,2015,38(9):1908-1911.

[6] 赖玲,刘华钢,秦艳娥,等.三七中3种皂苷类成分体内整合药动学研究[J].广西医科大学学报,2012,29(2):193-196.

[7] 游燕,张启云,郑琴,等.丹参和三七多种有效成分在大鼠体内的药物动力学研究[J].中药新药与临床药理,2010,21(6):614-618.

[8] 韩旻,傅韶,方晓玲.三七皂苷中人参皂苷Rg1与Rb1口服吸收及其体内药代动力学的研究和比较[J].药学学报,2007,42(8):849-853.

[9] 王蕾,唐星.三七总皂苷对甘草酸单铵在大鼠体内药动学的影响[J].中国新药杂志,2006,15(9):695-698.

[10] 冯亮,蒋学华.三七总皂苷在大鼠体内的药物动力学研究[J].华西药学杂志,2010,25(1):46-49.

[11] 刘厚甫.应用液质联用技术同时检测狗血浆样品中5种来自复方丹参滴丸的三七皂苷类成分的浓度[C]//中国质谱学会有机质谱专业委员会.中国有机质谱学第十三届全国学术大会论文集,2005:4.

[12] 张丝韵,宋敏,卢俊钢,等.丹参与三七配伍对主要活性成分药代动力学行为的影响[J].药学学报,2010,45(11):1433-1439.

[13] 张家伟,王晓明,潘桂湘,等.UPLC-MS/MS法测定大鼠灌服稳心颗粒后血浆中3个皂苷成分及其药动学研究[J].辽宁中医杂志,2016,43(8):1717-1720.

(收稿日期:2017-09-28)

(修回日期:2017-12-03;编辑:陈静)

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