人参皂苷Rb3木糖苷酶的 纯化及其酶学性质

赵信平,徐龙权,宋建国,鱼红闪

(大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034)

人参属(五加科)植物囊括了许多重要的药用植物,包括最广为人知的人参、三七、西洋参等,迄今为止已发现有12种[1],具有悠久的使用历史[2]。人参皂苷是人参属植物中的的重要活性物质[3],目前已分离鉴定出182种[4]。现代药理学研究发现,人参皂苷具有提高免疫、抗肿瘤、降血糖等多种生物活性作用[5-10]。人参皂苷是由糖和苷元相连而成的糖苷类化合物,按其苷元的结构不同分为3类[11]:二醇型人参皂苷(PPD),如Rbl、Rb2、Rc、Rh2、Compand K等;三醇型人参皂苷(PPT),如Re、Rgl、Rf、Rh1等[12]以及齐墩果酸型人参皂苷。其中人参皂苷Rbl和Re在天然植物中含量较高,而Rh1、Rh2、Compand K等含量甚微。最新药理学研究表明,有些稀有人参皂苷对于细胞凋亡的保护[13]、逆转白血病细胞的耐药性[14]、调节蛋白激酶C的活性[15]及抑制肿瘤细胞的增殖[16]等都具有很好的疗效。如果以含量较高的人参皂苷为底物,利用生物转化法大量制备稀有人参皂苷,具有广泛的应用前景[17]。

本论文研究的人参皂苷Rb3属于四环三萜类二醇型皂苷,其C-20位末端上连有一个木糖基。人参皂苷Rb3在木糖苷酶的作用下,脱去木糖基,释放出具有药效活性的苷元部分,可以与其它抗癌化合物合成抗癌药物。近年来国内外对木糖苷酶的研究日渐深入[18-22],Garciacampayo等[23]从Neocallimastixfrontalis中分离纯化的β-D-木糖苷酶的最适pH和温度分别为6.4、37 ℃;Dehnavi E[24]等首次将糖苷水解酶(GH)家族43β-木糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达,其重组蛋白的pH为4.8,最适温度为50 ℃。虽然目前已从多种微生物中分离出木糖苷酶,但是将其应用到天然木糖苷的生物转化的报道却很少。最近,实验室在霉菌中筛选到一株菌种Absidiasp.GRB3-X8r,此菌株发酵能产生木糖苷酶水解人参皂苷Rb3木糖基。本文通过对Absidiasp.GRB3-X8菌产的粗酶液进行分离纯化,得到能专一性水解人参皂苷Rb3木糖基的木糖苷酶,并对该酶的理化性质进行了深入研究,同时对该酶的催化特性进行了初步测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Absidiasp.GRB3-X8r(犁头霉) 大连工业大学生物工程学院菌种保藏所提供;人参皂苷Rb3、Rd、F2、C-K 实验室自制,HPLC纯度达到95%以上;实验所用人参皂苷Rb3、Rd 实验室自制,HPLC纯度达到80%以上;人参粉 北京同仁堂大连分店;麦芽汁 实验室自制;透析袋 上海新睿生物科技有限公司;硫酸铵、正丁醇、乙酸乙酯、磷酸氢二钠、柠檬酸、冰醋酸 天津市科密欧化学试剂有限公司。

DEAE-Cellulose DE52 What man公司;Silica Gel 60-F254薄层层析板 德国Merck公司;CS930双波长薄层扫描仪 日本津岛公司;BSZ-160自动部分收集器 上海金生达生化仪器有限公司;蛋白质电泳仪 Bio-Rad公司;GL-ZLM高速冷冻离心机 长沙市湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制方法 斜面培养基:采用察氏培养基,此培养基的配方为:NaNO30.3 g,KCl 0.05 g,KHPO40.1 g,FeSO40.001 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,蔗糖3 g,琼脂2 g,去离子水100 mL。将菌种接种此培养基上,恒温培养箱中29～30 ℃培养6～7 d。放置于4 ℃保藏待用。

人参浸出液的制备:称取人参粉100 g倒入烧杯,并在烧杯中加入600 mL水,温火加热,熬煮7 h,熬煮过程中补水100 mL;用纱布过滤,滤液于8000 r/min下离心10 min;得上清人参浸出液,补水至300 mL备用。

液体发酵培养基:取12 mL的人参浸出液加入48 mL的麦芽汁,再加入40 mL水补齐至100 mL(液体发酵培养基的麦芽汁糖度是5o,pH为6.8),制成人参皂苷Rb3木糖基水解酶液体发酵培养基。

1.2.2 粗酶液的制备 根据李明华等[25]研究的霉菌液体菌种的方法培养菌种,然后用移液枪取5 mL菌种接种到液体发酵培养基中,将接种了Absidiasp.GRB3-X8r菌株的液体发酵培养基置于恒温振荡器内,在29 ℃,160 r/min条件下培养4～5 d。将发酵培养好的100 mL发酵液,用高速冷冻离心机在8000 r/min下离心15 min,去除菌体,收集上清液;在磁力搅拌条件下,缓慢加入已研磨好的硫酸铵粉末至80%饱和度;于4 ℃下静置4 h。再用高速冷冻离心机在13000 r/min下离心20 min,弃上清,收集蛋白质沉淀。沉淀用10 mL 20 mmol/L pH3.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解,然后装入透析袋,用相同缓冲液透析24 h,约每2 h更换一次缓冲液。透析结束后,用高速冷冻离心机在13000 r/min下离心10 min,除去不溶性杂蛋白。所得上清液即为粗酶液。

1.2.3 酶的分离纯化 采用DEAE-Cellulose DE52阴离子交换柱对粗酶液进行分离纯化,向平衡好的离子交换柱中加入6 mL粗酶液,粗酶液上柱后依次采用由磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(20 mmol/L pH3.0)配制的浓度为40、50、60、70、80、90 mmol/L的KCl溶液进行梯度洗脱,每个梯度洗100 mL,控制流速为1 mL/min,每3 mL收集1试管。

1.2.4 薄层层析(TLC) 人参皂苷木糖苷酶水解人参皂苷Rb3生成人参皂苷Rd的酶反应检测TLC 条件是:展开剂为V(正丁醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(水)=4∶1∶2,喷10% H2SO4水溶液后,在105 ℃加热5 min显色。通过软件Bandscan分析TLC板上各个斑点的含量,从而来确定产物的含量,计算酶活力。

1.2.5 蛋白质相对分子量的测定 采用SDS-PAGE电泳法来测定人参皂苷Rb3木糖苷酶的纯度及其分子量[26-27]。其中浓缩胶为5%,分离胶为12%,电压分别为60 V和120 V。

1.2.6 蛋白质浓度的测定 采用Folin-酚法[28]测定酶液中的蛋白含量,以牛血清白蛋白作为标准。

1.2.7 人参皂苷Rb3木糖基水解酶的酶性质研究

酶的最适pH:用不同pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的缓冲溶液配制人参皂苷Rb3溶液。取50 μL纯化酶液与不同pH、浓度为0.2%人参皂苷Rb3底物溶液等比例混合,分别测酶活力,以最高酶活力作为100%计算相对酶活力,每个试验重复三次,以pH为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。

酶的pH稳定性:取50 μL纯化酶液与50 μL不同pH的缓冲液等量混合,室温下放置30 min,然后加入100 μL浓度为0.2%人参皂苷Rb3底物溶液,然后分别测酶活力,以未经处理过的酶活力作为100%计算相对酶活力,每个试验重复三次,以pH为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。

酶的最适温度:50 μL纯化酶液与50 μL浓度为0.2%人参皂苷Rb3底物溶液等比例混合,分别在25、30、35、40、45、50、55 ℃条件下反应,分别测定酶活力,以最高酶活力作为100%计算相对酶活力,每个试验重复三次,以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。

酶的温度稳定性:50 μL纯化酶液分别置于20、30、40、50、60、70、80 ℃下30 min迅速冷却到室温,加入等量的浓度为0.2%人参皂苷Rb3底物溶液,分别测酶活力,以未经保温处理过的酶活力作为100%计算相对酶活力,每个试验重复三次,以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。

金属离子对酶活力的影响:分别配制成含有2、5、25、50、100、200 mmol的KCl、NaCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H20、Cacl2、Pb(C2H3O2)2·3H2O、NiSO4·6H20、MnSO4·H20、EDTA的酶反应溶液,在pH3.0,温度为40 ℃下反应12 h,测定酶活力,确定这些金属离子对人参皂苷Rb3木糖苷酶活性的影响。

1.2.8 酶的动力学常数Vmax及Km测定 按照1.2.4酶活力的测定方法,测定在不同浓度的人参皂苷Rb3底物溶液下的酶活力,以酶反应速率的倒数(1/V)为纵坐标,底物浓度的倒数(1/[S])为横坐标,绘制Lineweaver-Burk图,计算酶动力常数Vmax及Km。

1.2.9 以Rb3为底物的酶活力的测定 人参皂苷Rb3木糖苷酶活力测定方法:取4 mg人参皂苷Rb3溶于1 mL 20 mmol/L pH3.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中,配制成人参皂苷Rb3底物溶液。取上述人参皂苷Rb3底物溶液50 μL,加入50 μL酶液混合,于40 ℃下反应24 h,然后加入200 μL水饱和正丁醇终止酶反应,振荡,分层,取上层液作薄层层析检测,并进行定量分析计算[29]。酶活力定义为:在上述条件下,每小时生成1 μmol人参皂苷Rd的酶量为一个酶活力单位(U)。

1.2.10 以pNP为底物的酶活性测定 以对硝基苯酚单糖苷(pNP-α-D-Gal,pNP-β-D-Gal,pNP-β-L-Ara,pNP-α-L-Rha,pNP-β-D-Xyl,pNP-α-D-Glu,pNP-β-D-Glu)为底物,反应体系250 μL,其中含有200 μL的0.08 mmol/L的pNP底物溶液,酶样品50 μL,40 ℃反应30 min后加入2.5 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应,测定405 nm下的吸光值。酶活力定义为:单位时间内释放1 μmol硝基苯酚的酶量定义为一个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 粗酶液的纯化

将微生物发酵后制备的粗酶液,经80%饱和度硫酸铵沉淀后,用DEAE-Cellulose DE52离子交换柱层析纯化,采用自动部分收集器对洗脱液进行收集,在280 nm紫外光下测定蛋白的吸光值,对洗脱曲线的出峰管进行酶活力测定,TLC显示有酶活力部分见图1,其对应的SDS-PAGE电泳检测结果见图2。TLC结果表明,67、68、69、70、71管中的提纯酶液与人参皂苷Rb3作用后,底物人参皂苷Rb3已被完全水解,出现了一条新的人参皂苷Rd条带,说明人参皂苷Rb3的木糖基被水解,从而转化生成了人参皂苷Rd。图2的SDS-PAGE电泳图中,第69管中的纯化酶出现单一的蛋白条带,说明酶蛋白得到了很好的纯化。

图1 出峰管酶活力测定结果Fig.1 Results of the enzyme activity of the peak tube were determined by TLC注:Rd,Rb3:人参皂苷标准品;数字表示出峰管号; S表示反应所用人参皂苷Rb3底物。

图2 酶蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE diagram of purified enzyme protein

经过硫酸铵沉淀以及DEAE-Cellulose DE52分离纯化的结果见表1。从表1中可以看出纯化后酶蛋白的含量为0.227 mg/mL,纯化倍数为13.33,回收率为9.02%。

表1 人参皂苷Rb3木糖苷酶纯化结果Table 1 Results of purification of ginsenoside Rb3 xylosidase

根据SDS-PAGE得到其相对分子量约为66.7 kDa。

2.2 人参皂苷Rb3木糖苷酶最适反应pH及其pH稳定性

图3最适反应pH表明,人参皂苷Rb3木糖苷酶在pH3.0 时酶活力最好,在接近中性环境下酶活力下降的较快,如该酶在pH5.0时相对酶活力为77.8%,而在pH6.0时相对酶活力为51.8%,pH大于9时,酶活力基本丧失,所以该酶在碱性环境下酶活力不高。由图3 pH稳定性可知,在pH2.2～6范围内,酶活力保持在80%以上,说明该酶在酸性环境下稳定性较高;在pH6～8.0范围内,酶活力保持在60%以上,说明该酶液在pH2.2～8范围内酶活力保持稳定。因此为了保持其酶活力,最好让该酶在酸性条件下保存。

图3 人参皂苷Rb3木糖苷酶最适反应pH及其pH稳定性Fig.3 Optimal reaction pH value and stability of the pH value of ginsenoside Rb3 xylosidase

2.3 人参皂苷Rb3木糖苷酶最适反应温度及其温度稳定性

图4最适反应温度表明,人参皂苷Rb3木糖苷酶最适反应温度为40 ℃,超过40 ℃后酶活性随着温度的升高而下降。50 ℃时相对酶活力为61.8%,而55 ℃时为45.6%。由图4温度稳定性可知,酶液在20～60 ℃保持30 min后,残余酶活力保持在80%以上,而当酶液在70 ℃以上保持30 min后,酶活力迅速下降至酶活力丧失,说明该酶在20～60 ℃范围内酶活力相对稳定。因此保存该酶时,温度不能超过60 ℃。

图4 人参皂苷Rb3木糖苷酶最适反应温度及其温度稳定性Fig.4 Optimal reaction temperature and stability of temperature of the ginsenoside Rb3 xylosidase

2.4 金属离子对人参皂苷Rb3木糖苷酶酶活力的影响

由表2可知,EDTA对照组中各浓度对酶活力无影响,K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+离子对人参皂苷Rb3木糖苷酶无明显作用。Zn2+、Pb2+、Ni2+金属离子对人参皂苷Rb3木糖苷酶有一定的抑制作用,特别是Pb2+、Ni2+的浓度大于100 mmol/L,Zn2+的浓度大于200 mmol/L时,对酶活力的影响较大,相对酶活力低于60%。

表2 金属离子对人参皂苷Rb3木糖苷酶酶活力的影响Table 2 Effect of metal ions on ginsenoside Rb3 xylosidase activity

2.5 人参皂苷Rb3木糖苷酶动力学常数Vmax及Km

在pH3.0、40 ℃条件下,以不同浓度的人参皂苷Rb3为反应底物,测定其与酶液的反应速率,采用Lineweaver-Burk法得到反应速率倒数与底物浓度倒数的关系曲线图(图5),计算得到该酶的Km值为65.63 mmol/L,Vmax为2.03 mmol/(h·L)。

图5 人参皂苷Rb3木糖苷酶的双倒数图Fig.5 Lineweaver-Burk plot of ginsenoside Rb3 xylosidase

2.6 以人参皂苷Rb3为底物的酶催化特性

采用1.2.2方法,对Absidiasp.GRB3-X8r菌进行液体发酵培养并提取粗酶液,共制备粗酶液50 mL。利用1.2.4和1.2.9方法,对粗酶液进行酶活力的测定,结果如图6所示。从图6(a)中可以看出人参皂苷Rb3完全被粗酶液水解,生成的产物主要是F2和C-K,没有检出人参皂苷Rd。可能是人参皂苷Rb3经粗酶液中的木糖苷酶水解掉C-20位末端上的木糖基生成人参皂苷Rd后,再经过其他人参皂苷酶[30]水解生成人参皂苷F2和C-K。为了验证以上的推测,以人参皂苷Rd为底物,用粗酶液进行了相同的酶反应,同时采用2.1中纯化得到的酶液以人参皂苷Rb3为底物进行酶反应,结果如图6(b)和图6(c)所示。图6(b)表明,人参皂苷Rd在粗酶液的作用下水解生成人参皂苷F2和C-K,图6(c)表明,纯化酶只能水解人参皂苷Rb3上的木糖基生成人参皂苷Rd。由此可以断定,微生物发酵后提取的粗酶液中,除了含有能水解人参皂苷Rb3上C-20位末端木糖基的酶外,还含有能水解其他糖苷键的人参皂苷酶。利用该粗酶液,就可将人参皂苷Rb3彻底水解,转化成F2和C-K。微生物产粗酶液水解人参皂苷Rb3的酶反应过程如图7所示。

图6 酶活力测定TLC图Fig.6 Results of enzyme activity were determined by TLC

图7 人参皂苷Rb3转化C-K过程Fig.7 Process of Rb3 transform to C-K

2.7 以pNP单糖苷为底物酶催化特性

用纯化后的第69管酶液,采用1.2.10方法,进行酶活力测定,结果如表3所示。表中数据表明,该酶不仅能水解β-D-木糖苷,还能水解β-D-半乳糖苷和β-D-葡萄糖苷,对α-D-半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷、α-L-鼠李糖苷、β-L-阿拉伯糖苷无水解能力,表现出独特的水解特性。

表3 木糖苷酶水解不同糖苷化合物的底物特异性Table 3 Substrate specificity of xylosidase to various glycosidases

3 结论

本文首次报道了来源于Absidia属微生物的木糖苷酶,对该酶纯化后表明,它能够高效水解人参皂苷Rb3上C-20位末端的木糖基,蛋白比活力达160 U/mg,明显高于其他一些来源于真菌的木糖苷酶。对该酶的性质研究发现,其最适反应pH为3.0,在pH2.2～pH8.0范围内相对稳定,这一点与已报道最适pH为中性或弱碱性的木糖苷酶有很大的不同。该酶的最适反应温度为40 ℃,在20～60 ℃范围内相对稳定。金属离子K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+离子对人参皂苷Rb3木糖苷酶无明显作用,Zn2+、Pb2+、Ni2+对人参皂苷Rb3木糖苷酶有抑制作用,并且随着浓度的增大,抑制作用越明显。SDS-PAGE电泳结果表明,该酶的分子量为66.7 kDa;反应动力学参数研究表明Km值为65.63 mmol/L,Vmax为2.03 mmol/(h·L)。对酶的催化特性的研究发现利用该菌产粗酶液,就可对三七茎叶中含量丰富的人参皂苷Rb3进行生物转化,进而生成F2和C-K,为今后有效利用三七茎叶皂苷及其在健康产品及医药方面的应用奠定基础。