干扰素-γ释放试验在诊断血液透析患者结核分枝杆菌感染中的价值*

徐明芝 李洪 白亚飞 陈汝满 王宇静

(1.海南省人民医院血液净化中心，海南 海口 570311；2.中南大学湘雅医学院附属海口医院血透科，海南 海口 570208)

慢性肾病患者需长期进行血液透析，才能维持其正常生活，但是长期维持血液透析往往会增加结核分枝杆菌感染率[1]。研究发现结核分枝杆菌感染的血液透析患者死亡率也显著高于普通血液透析患者[2]。慢性肾病会引起相关免疫功能缺陷，会使潜在性结核分枝杆菌感染发展为活动性疾病，这可能是造成其死亡率较高的主要原因[3]。目前早期筛选出结核高风险患者，并使用药物预防并治疗潜在性结核分枝杆菌感染患者是治疗结核病的最佳方法，此方法也被广泛应用于临床[4]。因此目前急需探寻诊断潜在性结核分枝杆菌感染的试验方法，做到早诊断、早治疗。本研究对结核菌素皮肤试验与干扰素-γ释放试验检测血液透析患者结核分枝杆菌感染的方法进行比较，评价不同方法检测血液透析患者结核分枝杆菌感染的临床应用价值，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 200例观察对象均为2015年9月～2016年9月于我院因肾病行血液透析且疑似结核感染患者，用结核菌素皮肤试验(TST)与干扰素-γ释放试验(IGRA)分别检测200例患者，男性103例，女性97例；平均年龄35～56岁；血液透析时间10～17天。分析比较两种方法诊断血液透析患者结核分枝杆菌感染的阳性率、敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率及与卡介苗接种和既往结核感染的相关性。入选标准：①符合第七版内科学肾病需血液透析诊断标准[5]。②透析患者有咳嗽、咳痰或咳血，乏力、盗汗、午后低热等结核感染症状，且过去6个月未服用免疫抑制剂及抗生素治疗。③经我院伦理委员会批准，并征得患者家属同意。排除标准：心、肝、肺等脏器可见显著病变患者；合并严重感染、凝血功能障碍等患者；透析前曾服用过抗结核药物或免疫抑制剂治疗患者。

1.2 仪器与方法

1.2.1 仪器与试剂 L550台式低速大容量离心机(湖南湘仪有限公司)， Multiskan MK3酶标仪(Thermo Scientific Microplate Reader)，电热数显恒温水浴箱(JOANLAB公司)等。试剂：PPD试剂(北京诺德生物科技有限公司)，结核杆菌特异性细胞免疫反应检测(ELISA) 试剂盒(北京诺尔贝迪科技有限公司)。

1.2.2 结核菌素皮肤试验(TST) 在患者前臂掌侧下三分之一部位皮肤处，注射PPD试剂0.1ml，至皮肤出现一5～6mm的圆形皮丘。注射时注意采用皮肤内注射法，且注射速度要缓慢，避免过快。同时注意观察患者有无不良反应。在48小时后用游标卡尺测量并记录硬结纵向和横向直径，硬结平均直径=(纵径+横径)/2。硬结平均直径如果在5mm以下为阴性反应；在5mm以上(包含5mm) 或局部有水疱、坏死、淋巴管炎等均判断为阳性反应[6]。

1.2.3 干扰素-γ释放试验(IGRA) 取待测者空腹8小时后静脉血3～5ml，加入肝素抗凝，颠倒混匀后，均分成三等份分别加入试剂盒三种不同试剂管(试剂管内装分别装有阳性反应剂、阴性反应剂和结核抗原)中，再次混匀后，37℃水浴箱内孵育24小时，离心取上清液，严格按照说明书步骤检测γ-干扰素。最后用酶标仪检测分析实验结果，记录。按测量数据绘制标准曲线，并判断结核分枝杆菌感染情况。

1.2.4 结核感染诊断标准 根据患者临床表现、病理学诊断、痰涂片和细菌培养及X线等辅助诊断，并结合2016《ATS/IDSA/CDC临床实践指南：成人和儿童结核病的诊断》临床诊断标准判断患者是否为结核分枝杆菌感染。

2 结果

2.1 两组试验方法阳性检出患者一般情况比较 两种试验方法阳性检出患者年龄、血液透析时间、有卡介苗疤痕人数、性别等均无统计学差异(P>0.05)，见表1。

2.2 两种试验方法检测结果比较 结核菌素皮肤试验与干扰素-γ释放试验检测血液透析患者结核分枝杆菌感染结果有统计学意义(P<0.05)，干扰素-γ释放试验检测阳性率显著高于结核菌素皮肤试验(P<0.05)，见表2。

表1 两种试验方法阳性检出患者一般情况比较±s)Table 1 The general data of positive detection of patients

表2200例血液透析患者结核分枝杆菌感染检测结果比较

Table2ThehemodialysispatientswithMycobacteriumtuberculosisinfection

IGRATST(n)阳性阴性合计[n,(×10-2)]阳性6393156(78)阴性39544(22)合计102(51)98(49)200231.837P0.000

2.3 BCG疫苗接种、结核病史与两种检测方法相关性比较 IGRA检测阳性与卡介苗接种史、结核病史均相关(P<0.05)，TST检测阳性与卡介苗接种史具有相关性(P<0.05)，但与结核病史不相关(P>0.05)，见表3。

表3BCG疫苗接种、结核病史与两种检测方法相关性比较

Table3TherelationshioofBCGVaccinationandTuberculosisHistoryandthetwodetectionmethods

因素IGRA阳性TST阳性RPRPBCG疫苗接种6.430.032.540.02结核病史5.570.013.660.96

2.4 两种试验方法灵敏性、特异性比较 干扰素-γ释放试验灵敏性、特异性均高于结核菌素皮肤试验，其假阳性率、假阴性率均低于结核菌素皮肤试验，见表4。

表4 两种试验方法灵敏性、特异性、假阳性率、假阴性率比较[n(×10-2 )]Table 4 The sensitivity, specificity, false positive rate and false negative rate

3 讨论

长期维持透析的肾病患者，由于免疫功能缺陷、营养不良等多种原因，其感染结核分枝杆菌的概率比正常人群高10～25倍[7]。近年来，随着慢性肾病需维持透析的患者人数不断增加，血液透析合并结核分枝杆菌感染人数也随之增加，由于其发病隐匿，患者抵抗力差，结核杆菌多通过血液播散到全身多个脏器，预后多不好，且死亡率较一般结核感染者高[8]。目前早期筛查选出结核高风险患者，并使用药物预防治疗潜在性结核分枝杆菌感染患者是治疗结核病的最佳方法，也被广泛应用于临床[9]。因此目前急需探寻诊断潜在结核分枝杆菌感染的试验方法，做到早诊断、早治疗。较早发现、检测并治疗潜在的结核杆菌感染者，可以有效防止其发展到活动性结核，避免其感染他人和医务工作者。这就使得在长期维持透析的肾病患者中筛查结核杆菌感染者变得尤为重要，因此目前临床上提倡应对长期维持透析的肾病患者定期筛有无结核杆菌感染。结核菌素皮肤试验(TST)长期以来一直是检测结核杆菌感染的标准方法[10]。然而，结核菌素皮肤试验仍存在一些缺点和不足：①透析患者结果敏感性、特异性不足，试验结果易出现较多假阳性、假阴性。②会与接种过卡介苗的非结核分枝杆菌交叉反应，影响试验结果。③结核菌素皮肤试验若出现强阳性反应，会给患者带来强烈的不适感，严重影响患者及家人正常生活。④结核菌素皮肤试验试验耗时较长，干扰因素较多，且会给患者生活带来诸多不便[11]。

随着科技水平的不断进步与发展，分子生物学技术也不断提升，干扰素-γ释放试验检测血液透析结核杆菌感染也被广泛应用于临床[12]。当结核杆菌入侵人体机体后，其特异性抗原会激活机体内血液和体液内单核细胞，并刺激T淋巴细胞及自然杀伤细胞释放大量干扰素-γ[13]。这便是干扰素-γ释放试验检测血液透析结核杆菌感染的主要原理。孙琳等[14]发现结核分枝杆菌感染时，会在体内产生大量的外源性抗原和内源性抗原，经抗原提呈细胞处理后，经过MHCⅡ类和MHCⅠ类两种不同抗原处理、提取方法，最终被CD4+T、CD8+T细胞识别处理。激活的CD4+T细胞可增加干扰素-γ释放，同时干扰素-γ释放又刺激抗原提成细胞，使其表面的MHCⅡ分子表达增加，最终增加提成细胞的抗原提提成能力[15-17]。更重要的是，干扰素-γ是一种巨噬细胞的强效激活因子。机体内感染过程的进展与预后，与淋巴细胞和巨噬细胞两者的相互作用密切相关，机体感染结核杆菌后，巨噬细胞作为机体内的首道防御细胞会大量吞噬结核分枝杆菌，并会在巨噬细胞内将其消化成不同大小的片断[18]。研究表示，有部分干扰素-γ来源于激活的CD8+T细胞[19-20]。因此，被结核分枝杆菌刺激过的淋巴细胞，会产生相应的免疫记忆，当相关抗原再次入侵机体时，Th1细胞会受到刺激释放干扰素-γ。因此，体内干扰素-γ释放水平大连升高可能提示结核杆菌感染或结核杆菌致敏[21-22]。

干扰素-γ释放试验作为当前筛查和诊断透析患者结核感染的一种辅助诊断，弥补了结核菌素皮肤试验的一些不足，其试验耗时短，且给受试者带来的影响较小。但是其同样存在一些不足之处：①试验需要采取一定量的静脉血，会对患者进行有创操作，需要患者具有一定的依从性。②采集的静脉血需及时处理，如若样本放置时间较长，可能会影响试验结果的准确性，一般采集的新鲜血液要在2小时内尽快完成试验。③干扰素-γ释放试验在孵育过程中，要注意避免污染，影响检测结果。④该试验对实验室条件、试验操作人员均有较高要求，且检测成本较高，在基层医院推广有一定难度。因此，为了进一步提高临床确诊率，患者诊断过程中应该根据本地区经济条件、实验设备进行诊断，患者可以先进行荧光定量TST检测，对于疑似患者则可以进行干扰素-γ释放试验，发挥不同诊断方案优势，达到优势互补。

4 结论

研究结果显示，相较于结核菌素皮肤试验，干扰素-γ释放试验检测血液透析患者结核分枝杆菌感染检出阳性率高，结果更准确，敏感性、特异性高，假阳性、假阴性率低，更适用于长期血液透析患者对结核杆菌感染情况的筛选，可在临床推广应用。