佩兰乙醇提取物对结肠癌RKO细胞的抑制作用研究

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1.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563000；2.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室，贵州 遵义 563000；3. 遵义医学院基础医学院，贵州 遵义 563000

结肠癌是发病率较高的消化道恶性肿瘤之一，其年发病率和死亡率在逐渐升高。近年来针对肿瘤的综合治疗水平在不断提升，但并不能有效遏制结肠癌的进展过程，结肠癌的死亡率仍居高不下。结肠癌的防治关键之一在于寻求有效抑制结肠癌细胞生长的药物，探究潜在的天然产物作用对结肠癌的防治具有重要意义[1]。佩兰为菊科泽兰属植物佩兰EupatoriumfortuneiTurez的地上部分，又名香草、小泽兰、大泽兰、鸡骨香，主产于华东、华南和西南等地区，味微苦，性寒，具有清热解暑、芳香化湿、健胃开胃、杀虫抑菌等功效[2]。现代药理研究证明，佩兰提取物具有抑菌、抗炎、降脂等作用[3-5]，但其抗肿瘤活性方面的研究报道很少，其抗肿瘤机制也不明[6-7]。本研究拟通过开展佩兰乙醇提取物体外抑制结肠癌RKO细胞增殖进行初步研究，以期为后期发现佩兰抗癌活性单体化合物奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 3131型CO2培养箱、Multiskanspectrum全波长酶标仪(美国Thermo公司)、NikonYS100荧光显微镜(日本Nikon公司)、化学发光仪(美国伯乐公司)。

1.2 材料 佩兰采自四川，由遵义医学院医学与生物学研究中心宋长伟博士鉴定，标本存放在医学与生物学研究中心样品保存室。RPMI-1640培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(BI公司)；PBS粉末(BBI Life sciences公司)；SRB(Sigma公司)；Hoechst 33342染料(碧云天公司)；Bcl-2、Cleaved-caspase-3抗体(CST公司)。

1.3 结肠癌细胞株 人结肠癌RKO细胞购于上海吉凯公司。

2 方法

2.1 乙醇回流提取法获得佩兰乙醇提取物 称取100 g佩兰粉碎成粗粉，用75%乙醇浸泡2 h，回流提取3次，合并滤液减压蒸馏得到佩兰提取物浸膏。

2.2 SRB法检测佩兰乙醇提取物对结肠癌RKO细胞增殖抑制的影响 取对数生长的细胞，以2×104个细胞/孔的浓度接种于两块96孔板，一块为对照板(T0)，一块为实验板；CO2培养箱中培养24 h后，对照板(T0)取出进行SRB染色，在530 nm波长下测定 OD值。染色流程如下：弃掉培养基，加入10% TCA固定液4℃条件下固定2 h；蒸馏水洗涤3次后自然晾干，每孔加入100 μL的4 mg/ mL的 SRB溶液，室温下染色15 min；弃上清，1%的醋酸冲洗5次、甩干，每孔加入100 μL的10 mM Tris溶液。利用DMSO溶解佩兰乙醇提取物后，用培养液稀释成不同浓度(3 μg/mL、6 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL)的药液，且DMSO的终浓度不能超过0.5%。实验板中加入上述配制好的不同浓度的药液作为实验组(T)，并设对照组(C)(加入200 μL培养基)，每组5个复孔，CO2培养箱中培养24 h后进行 SRB染色并测量OD值，按以下公式计算肿瘤生长抑制率。

2.3 倒置显微镜观察佩兰乙醇提取物对RKO细胞形态的影响 细胞接种于两块96孔板(2×104个/孔)，方法同2.1。实验分为对照组(加入200 μL培养基)和实验组(佩兰乙醇提取物组终浓度为 5 μg/ mL、7.5 μg/ mL、10 μg/ mL)。细胞加药培养48 h后，倒置显微镜下观察 RKO细胞形态的变化。

2.4 Western blot 检测Bcl-2和Cleaved caspase-3的表达 RKO细胞以 5×105个/孔接种于 6 孔板中，培养24 h 后，实验分组：对照组(加入200 μL培养基)、佩兰乙醇提取物组(终浓度为5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL)，培养48 h；提取细胞总蛋白，BCA测定蛋白样品浓度，根据上样量20 μg与5×蛋白上样缓冲液混合，沸水煮沸10 min 使之变性。取样品做 SDS-PAGE，全湿式电转法将分离胶上的蛋白转移到 PVDF 膜上； 封闭液封闭 1.5 h，分别加入一抗β-actin抗体、Bcl-2抗体、Cleaved caspase-3抗体，4℃孵育过夜，二抗(1∶1000)室温孵育2 h；ECL化学发光检测目的蛋白，在凝胶成像系统上测量灰度值并计算Bcl-2蛋白与Cleaved caspase-3蛋白的相对表达。

3 结果

3.1 佩兰乙醇提取物对结肠癌RKO细胞生长抑制的影响 由图1可知，佩兰乙醇提取物浓度为3 μg/mL时已对RKO细胞的生长具有抑制作用；随着佩兰乙醇提取物浓度的增加，RKO细胞的生长抑制率增加；当浓度为25 μg/ mL时，RKO细胞的生长完全被抑制。

3.2 佩兰乙醇提取物对RKO细胞形态的影响 与对照组比较，佩兰乙醇提取物终浓度为5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/m作用48 h后，实验组RKO细胞数量逐渐减少、细胞明显皱缩变圆。如图2所示。

3.3 佩兰乙醇提取物对RKO凋亡过程中Bcl-2、Cleaved-caspase-3蛋白的变化 与对照组相比，当佩兰乙醇提取物浓度从5 μg/mL至10 μg/mL，均能使Bcl-2蛋白的相表达量降低，降低程度随着佩兰乙醇提取物浓度的增加而增加；同时Cleavedcaspase-3蛋白相对表达量呈浓度依赖性增加。当佩兰乙醇提取物浓度10 μg/mL时，Bcl-2和Cleavedcaspase-3蛋白与对照组相比有显著差异。如图3～4所示。

4 讨论

我国2015年癌症统计数据显示结直肠癌病例在全部恶性肿瘤中均位居5，其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万，已成为严重危害中国人健康的疾病[8]。化疗仍旧是临床治疗结直肠癌的主要手段之一，寻求有效抑制癌细胞生长的药物对肿瘤的防治具有重大的意义。佩兰始载于《本草再新》，《神农本草经》列佩兰于上品；1983年国外学者在佩兰中发现了相对含量较高的挥发油、倍半萜烯类、萜醇类和黄酮类物质[6]；药理学实验证明佩兰中的倍半萜内酯及黄酮类在体外实验中均具有抗癌活性；1993年李美丽等[7]报道了菊科佩兰属植物含有双稠吡咯啶生物碱，该生物总碱在体外试验中表现出一定的抗肿瘤活性。目前，对佩兰其他抗肿瘤活性成分及其机制的研究鲜见报道；为进一步明确佩兰的抗肿瘤效果与机制，本研究以乙醇回流提取法获得佩兰乙醇提取物并作用于结肠癌RKO细胞，观察佩兰乙醇提取物对RKO细胞的抑制效应。结果显示佩兰乙醇提取物对RKO细胞的生长具有抑制作用，抑制效果随着浓度增加而升高；倒置显微镜观察显示佩兰乙醇提取物作用于RKO细胞后，细胞核发生皱缩或裂解等细胞凋亡的形态学改变；与细胞凋亡相关的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达呈剂量依赖性降低，而活化形式的促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表达则呈剂量依赖性降低。以上结果提示佩兰乙醇提取物呈浓度依赖性地促进RKO细胞的凋亡。

细胞凋亡受多条信号通路调控，众多关键蛋白在凋亡中发挥重要作用；其中Bcl-2基因被称为“存活基因”，其基因产物Bcl-2蛋白具有抑制细胞丢失、阻止细胞凋亡的作用[10]；Bcl-2基因激活与大肠癌分化、转移有关，可作为大肠癌预后的指标之一[11]。激活的Caspase-3蛋白是细胞凋亡的执行者，具有剪切管家蛋白和DNA片段的功能，是参与凋亡途径的关键效应分子。本研究发现佩兰乙醇提取物可以使RKO细胞Bcl-2蛋白表达降低，而活化的Caspase-3蛋白表达增加；佩兰乙醇提取物可能通过抑制了Bcl-2蛋白的表达、促进活化的Caspase-3蛋白的表达而达到促细胞凋亡作用。

综上所述，佩兰乙醇提取物可以抑制RKO细胞生长，通过抑制Bcl-2蛋白的表达和促进caspase-3蛋白的活化而促使RKO细胞发生凋亡；具体何种成分发挥了该功效需要进一步通过天然药物化学的分离技术辅以活性追踪的手段捕捉活性单体化合物。