稳定同位素技术在农产品安全中的应用研究进展

靳欣欣，潘立刚，李 安

（北京农业质量标准与检测技术研究中心/农业部农产品质量安全风险评估实验室，北京 100097）

俗话说，民以食为天，随着人们生活水平的提高，农产品安全也成为社会舆论关注的热点。随着安全事件频发及国家有关方面的重视，对农产品检测技术的要求也越来越高，作为近年来发展较快的检测技术。稳定同位素质谱具有高灵敏度、低检测限的特点，在农品产地溯源及掺杂、鉴别中应用越来越广泛。其独特的原理也使其获得独特的应用优势，如葡萄酒中掺入甘油，单花蜜中掺入杂花蜜等掺假鉴别；有机食品与非有机食品的鉴别等。

稳定同位素技术一直主要应用于产地溯源和掺杂判别，近年来关于农田环境中有机污染物的来源追溯、降解机理、转化途径及量化转化程度方面的研究也在陆续开展。

1 稳定同位素质谱的基本原理概述

相同元素的原子中，由于原子核含有的中子数目不同，这些原子被称为同位素，其中包括稳定同位素和放射性同位素。稳定同位素，不具有放射性，在研究中比较安全，针对稳定同位素的检测的应用也日益广泛[1]，如1H和2H，12C和13C，16O、17O和18O。

稳定同位素质谱（Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS）即所检测的样品中目标元素稳定同位素的丰度（以原子百分计的同位素的相对含量）。在自然界中，生物体与其所在环境会进行物质交换，其同位素组成会因此发生变化，这种现象称为同位素分馏，也是造成不同来源物质中同位素差别的原因，可以视为外界环境对生物体打下的特征印迹[2]。利用该原理，IRMS技术可以开展来源追溯、降解机理、转化途径及量化转化程度等方面的研究。在具体的测定中，使用国际公用的参照标准物的相对量来表示同位素的富集程度，表达式[3]为：

式（1-1）和（1-2）中，δ‰表示稳定同位素的比率，R样品表示测定样品中重同位素和轻同位素丰度比，R标准表示国际标准样品中重同位素和轻同位素丰度比。

表1 常见同位素的分馏原因及其在食品溯源中的应用

2 稳定同位素技术在产地溯源和有机判别中的应用

不同产地和生长环境的农产品，在生长过程中受不同的外界环境影响，吸收不同来源的营养物质，这些都会使农产品发生同位素分馏，产生具有产地特性的特征值，也是进行产地溯源及真伪鉴别的基本原理。常应用的几种同位素的分馏原因及其指示信息[3]见表1。

在稳定同位素技术中，产地溯源和掺杂鉴别在农产品安全中应用最为广泛，技术上也相对成熟，已有大量相关文献进行综述。在有机和非有机蔬菜生产中的应用也已有广泛报道。

有机食品是国际上对天然、无污染食品统一的名称，通常来自于有机农业生产体系，根据国际有机农业生产要求和标准生产加工。对于有机食品的认证要求中包括生产基地在3年内未使用过农药、化肥等违禁物质，这点与传统农业大多使用化学合成肥料不同，后者可以根据植物不同生长阶段的需求提供其可以利用的营养元素；因此，二者在肥料使用上差异较大，也正是这种不同的种植方式奠定了有机食品鉴别技术的基础[4]。

IRMS法检测H、C、N、O、S这些在植物组织中大量存在的元素，精密度可达0.01%～0.20%，且前处理过程较为简单；其中，研究认可δ15N可作为植物不同肥料管理的研究参数，其被视为有机食品确证的潜在标记物[5]。

李光德等[6]分析了北京郊区5个有机和1个常规蔬菜生产基地的蔬菜和土壤样品，对其δ15N值进行了测定并找寻规律特征，结果表明：有机生产时间和有机肥中氮投入增加，土壤全氮和δ15N都有一定的增加，且当季农作物对于肥料中δ15N反应敏感，通过研究发现δ15N可作为蔬菜是否使用了化学合成氮肥检测的“有效工具”，但同时应结合生产记录等措施进行综合判定。姚志鹏等[7]研究了不同施肥条件下土壤和莴苣不同部位的同位素特征变化情况，设置条件包括施有机肥、尿素和局部施尿素，结果发现：各肥料条件下土壤δ15N值与莴苣δ15N值的差异及变化规律为先升后降再趋平，但莴苣不同部位δ15N则存在一定规律性；总体上，莴苣内叶和土壤δ15N值变化可以作为有机蔬菜种植过程中氮肥的使用种类的鉴别指标。除了δ15N，δ18O也可被结合利用测定二维同位素值来进行鉴别。Mihailova等[8]发现，在生菜、番茄、马铃薯的种植中，施用有机肥料的δ15N较化学合成肥料的δ15N为高，而δ18O则明显为低，这种氮氧二维同位素的鉴别方法准确度可达84.8%。

3 稳定同位素在农田环境中的应用

因为农田环境的复杂性，稳定同位素技术的应用受到限制，单体同位素分析（Compound-Specific Isotope Analysis，CSIA）及更进一步的二维（2-D CSIA）到多维（MD CSIA）单体同位素分析技术拓展了其在该领域的应用范围。

CSIA技术是20世纪90年代发展成熟的一门现代化分析技术[9]，是将气相色谱与稳定同位素质谱仪联用，利用了色谱的分离能力，将样品中的目标化合物分离之后再进行同位素检测，被检测的同位素可以是一种元素，也可以是2种或多种元素，即为二维单体同位素分析和多维单体同位素分析。CSIA技术能测定单个化合物中特定元素的同位素比率组成，不会受其他化合物干扰，大大提高了测定结果的可靠性，然而农田环境的复杂性仍可能造成目标化合物的浓度与被测单体同位素改变的非线性波动，其浓度减小并不意味着目标物的消除，引起浓度变化的原因也不能够肯定[10]，而2-D CSIA和MD CSIA可进一步克服这个缺陷。

3.1 来源追溯

有机化合物进入环境中时有自己的特征同位素组成，在特定的环境领域，若化合物同位素组成保持不变，可直接利用其同位素组成进行来源示踪[11]。某些有机化合物的同位素组成在环境中会发生规律性的变化，反应物中由轻同位素（12C）形成的分子键的键力较弱，反应速率高于由重同位素（13C）形成的分子，导致在生成物中的重同位素逐渐富集（偏正），而反应物的重同位素逐渐贫化（偏负）[12]。以此可进行农田环境污染物的来源追溯。

农业流域非点源污染[13]主要为农村生活和农业生产中产生的呈非点状形式扩散和排放的污染物，其对水域造成的污染问题的日益突出已使农村污染河网水系水质的提升及水体修复被国家列为当前流域管理和农村可持续发展的主要工作方向之一[14]，要解决这一问题，需要对农业流域进行有效管理，并解析污染来源。

硝态氮是农业流域的一大类污染源，基于15N-18O双稳定同位素的硝酸盐追溯技术是目前的主流方向。Harden等[15]通过在美国农业小流域开展有机肥和传统化肥对流域水质影响差异的试验，结果表明：施加有机肥所在流域水体硝酸盐的δ15N高于施加传统化肥的δ15N，但硝酸盐的δ18O并无明显差异。Liu等[16]则是发展了15N-17O-18O三稳定同位素法，强化了对于黄河水体硝酸盐来源的解析能力，结果表明：黄河中的硝酸盐污染源7%来源于未经处理的大气，陆源污染则在不同流域有不同的主要污染来源。Lu等[17]结合15N-18O的稳定同位素值与贝叶斯模型（SIAR）研究了三江平原农业集约化对于水体污染源的影响，结果表明：在丰水期污染源主要为化学肥料和土壤氮肥，枯水期污染源主要为粪便和污水。

3.2 降解研究

污染物在进入环境之后，可通过物理、化学、生物作用自然衰减，包括降解作用与非降解作用两部分。其中非降解作用包括挥发、扩散、吸附等，在这一过程中，污染物结构并不发生变化；降解作用主要指化学和生物降解，在降解过程中会使得污染物化学性质发生改变[18]，降解作用有从本质上去除污染物的有效作用，其速率是自然衰减消除污染物的关键，而通常只有化学键的断开或者形成，才能使有机化合物的同位素产生明显的分馏[19-20]，CSIA可根据同位素分馏识别并量化生物降解作用，已成为自然衰减降解监测的重要技术。

多环芳烃是一类环境中广泛存在的有毒有机化合物，由2个或以上的苯环以线性排列、弯曲连接或聚簇状的方式构成，具有致畸、致癌、致突变的作用[21]。农田土壤中的多环芳烃主要来源于大气污染、污水灌溉、污泥等[22]，其微生物降解机理是一大研究热点。焦杏春等[23]应用单体碳同位素分析技术对农田土壤中的多环芳烃的植物降解过程进行了定量表征，结论表明：玉米根对土壤的多环芳烃有一定的清除作用，3环以下的多环芳烃更倾向于被降解和清除。将稳定同位素标记的目标化合物添加入环境样品中，结合分子生物学手段进行微生物群体和个体之间稳定同位素的流动的方法称为稳定同位素探针（Stable isotope probing，SIP）技术[24]，应用于研究污染物的微生物降解机理，具有广阔的发展前景[25]。Guitierrez等[26]在坦帕湾的藻花上验证了全标记萘为基质运用的DNA-SIP技术可以从海水中鉴定出萘降解菌。Zhang等[27]则应用DNA-SIP从受污染水域的底泥中鉴定出了3种蒽降解菌。

稳定同位素在其他农田污染物降解中的应用有：钱毅光[28]研究了有机氯杀虫剂六氯环己烷厌氧条件下降解过程的碳同位素分馏特征与降解机理，并对比分析了六氯环己烷不同对映异构体的降解特征，验证了稳定同位素分析与对映体同位素分析技术结合使用来研究环境中有机对映体污染物的微生物降解转化路径与机理的有效性。Uhlik等[29]利用DNA-SIP技术对被多氯联苯和多环芳烃复合污染的土壤进行了研究，发现土壤中的苯甲酸盐降解菌和联苯降解菌同样可以萘为碳源进行代谢，揭示了土壤微生物宽泛的生物降解能力。

3.3 转化途径

在有机污染物的转化过程中，同位素分馏的分馏值大小在很大程度上取决于断裂或形成键的类型以及过渡态化学键断裂或形成的程度；以δ13C为例，利用瑞利方程来表征反应残留物与反应起始物的关系。

式（3-1）中，f代表残留分数，Cx和Co代表反应残留物与起始物的同位素值(13C/12C)，ε为降解系数，α为分馏因子（α=KIE-1），ε=1 000×（α－1）[30]。

Kuder等[31]通过研究并计算出了有机污染物甲基叔丁基醚厌氧降解过程中碳、氢同位素的分馏因子，通过与已知的C-O键和C-H键数值相比，断定出甲基叔丁基醚转化的第一步是酶促水解C-O键断裂而非C-H键断裂。

由于CSIA评价有机污染物转化通过污染物的碳、氢信号来判定，而13C、2H在污染物中是平均分布的，只有反应位点的13C、2H具有活性；因此使用具体反应位点的动力学常数（AKIE）更为准确。

式（3-2）中，εrp为具体反应点AKIE的降解系数[32]。

Zwank等[33]计算了甲基叔丁基醚厌氧降解过程中碳、氢的AKIE，与预期亲核取代反应的AKIE值吻合，表明这一转化过程属于SN2反应机理。

4 小结

稳定同位素技术凭借其独特的技术原理，在农产品产地溯源和掺杂鉴别方面中有突出优势与无可替代的地位，针对当前的一些棘手的食品安全事件也可以有效地解决，比如三聚氰胺非法添加奶粉[34]，以及进口橄榄油、中药材、茶叶等的产地溯源与真伪鉴别，稳定同位素技术均可扩展到不同的应用领域[35]，尤其是现在大热的有机食品鉴别，为将来研究发展的一个热点。

稳定同位素在农田环境方面的应用，包括了污染物溯源、降解研究和转化机理等，依靠与色谱分离能力结合的单体和多维单体同位素分析技术，极大地扩展了其应用领域并提高了检测的准确度；同时与其他学科的联合应用，包括与分子生物学联合的稳定同位素探针技术在土壤生物降解方面的应用及在物理化学和反应动力学上探寻污染物转化机理的应用，其都是未来稳定同位素技术发展的方向。