HPLC法测定人血浆中的氢氯噻嗪及其在药代动力学研究中的应用

张国兰，马瑞娟，闵云燕

(郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院，郑州儿童医院，郑州 450018)

氢氯噻嗪(6-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪-7-磺酰胺-1，1-二氧化物，HCT)为噻嗪类利尿药，具有利尿、降压作用，属于苯并噻唑类化合物，是一种无臭无味的白色结晶粉末，微溶于水，溶于甲醇。它通过减少肾小管中电解质的再吸收，造成钠离子和氯离子排泄的增加，从而导致水的排泄增加。氢氯噻嗪能增加镁离子、钾离子排泄，减少钙离子排泄。

已有文献报道采用HPLC法[1-6]、高效液相色谱-质谱/质谱联用法[7-16]和毛细管电泳法[17-19]等不同检测技术的方法用于测定复方降压药中氢氯噻嗪的含量以及单独服用氢氯噻嗪或与其他药物、生物液体合用时的质量浓度。然而这些检测方法需要复杂的仪器设备、灵敏度较低、耗时较长，因此开发一种简便快速的氢氯噻嗪测定方法十分重要。

笔者建立了一种准确、灵敏的用于测定人血浆中氢氯噻嗪质量浓度的HPLC法，并对该方法进行了验证。该方法也成功地应用于氢氯噻嗪片的中国人体内的药代动力学研究。

1 仪器与试药

1.1仪器 安捷伦1100高效液相色谱仪系统(美国安捷伦公司)，配备了G1379A在线真空脱气机、G1311A四元输液泵、G1316A柱温箱、G1313A自动进样器及G1315B二极管阵列检测器。

1.2试药 氢氯噻嗪(质量分数>98.0%，批号LOT50183243)，氟康唑(质量分数>98.0%，批号LOT3968F450)，均购于美国Sigma公司。乙腈(色谱纯)、三氟乙酸(色谱纯)、乙酸乙酯、正己烷和磷酸二氢钠，均购于百灵威公司。超纯水(电阻>18 mΩ)，用美国密理博公司的Milli-Q纯化系统制备。

2 方法

2.1样品的制备

2.1.1对照品和质控样品 氢氯噻嗪储备液(100.0 μg·mL-1)和氟康唑储备液(IS，10.0 μg·mL-1)用甲醇稀释制得。用于校准和质量控制的工作液用甲醇稀释储备液制得。所有配制好的溶液均保存于4 ℃的冰箱中。

氢氯噻嗪对照品系列溶液分别由人空白血浆加入适量的工作溶液制得，最终制得氢氯噻嗪对照品溶液的质量浓度分别为5，10，25，50，100，200，300和400 μg·mL-1。质控(QC)样品使用同样的方法进行制备，其质量浓度分别为10，80和320 μg·mL-1。

2.1.2血浆样品制备 向10 mL的EP管中加入500 μL血浆样本和50 μL的内标氟康唑溶液(300 ng·mL-1)，混合1 min，然后加入500 μL质量浓度为50 g·L-1的磷酸二氢钠溶液，4 mL的乙酸乙酯和1 mL的正己烷。涡旋混合2 min后以13 000 r·min-1离心10 min，上层清液被分离收集并在37 ℃条件下用氮气吹干。残留物加入200 μL的流动相，涡旋混合3 min使其重新溶解，以13 000 r·min-1离心10 min，取20，40，60，80和100 μL等20 μL的整数倍进样量进样分析。

2.2色谱条件 色谱柱采用 AgilentZOR-BAX Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，带有保护柱XDB-C18protection 色谱柱(12.5 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相使用乙腈∶1 mL·L-1三氟乙酸∶水=20∶40∶40；检测波长：266 nm；流速：0.8 mL·min-1。

2.3方法验证 通过分别测定空白血浆样品和加入了氢氯噻嗪、内标氟康唑的血浆样品来评估该方法的选择性。校正曲线通过连续3 d分析加标校准样品进行验证。以血浆中待测物质量浓度为横坐标(x)、待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标(y)，用加权最小二乘法(W=1/x2)进行回归运算，求得回归方程，氢氯噻嗪的线性范围为5～400 ng·mL-1。选择血浆中氢氯噻嗪的定量下限(LLOQ)作为校准曲线中使用的最低质量浓度。

2.3.1准确度和精密度 通过测定10，80和320 ng·mL-13个质量浓度水平质控样品来评估方法的准确度和精密度。方法的精密度用RSD值表示，准确度用相对误差(RE)表示。

测定血浆样品中氢氯噻嗪的峰面积与样品萃取前的峰面积，与萃取后添加氢氯噻嗪溶液的血浆样品的峰面积进行比较，测定氢氯噻嗪在3个质控质量浓度水平(n=6)下的萃取回收率。以类似的方法测定内标氟康唑(300 ng·mL-1)的萃取回收率。

2.3.2方法稳定性 在不同条件下，重复5次分析3种质量浓度(10，80和320 ng·mL-1)水平的血浆样品来测试人血浆中氢氯噻嗪的稳定性。分别测定在室温下存放4 h的加标样品、在4 ℃条件下在自动进样器中放置了24 h准备测定的萃取后的样品，确定该方法的短期稳定性。测定连续3 d 在-20 ℃条件下3次完全冻融循环后的样品，评估冻融稳定性。测定在-20 ℃条件下储存28 d后的加标血浆样品，评估该测定方法的长期稳定性。

2.4药代动力学研究 实验方案在本研究工作开展前得到了郑州儿童医院医学伦理委员会的审查批准(批件号ICE-C-004-A06-V1.0)。按照赫尔辛基宣言的原则，选取20名男性健康志愿者，平均年龄26.5±3.1岁，体质量66.2±5.8 kg，志愿者均签署知情同意书，同意参加该临床研究。在研究工作开展前对提交了参与本项目协议的志愿者进行了血常规、尿常规、心电图、肝肾功能、血压和血糖等项目的检查，志愿者各项检查指标均正常。志愿者在开始测试的前7 d内未服用其他任何药物，同时要求志愿者在研究工作开始前24 h禁烟禁酒，直到实验结束。所有志愿者都用200 mL的水口服了剂量50 mg的氢氯噻嗪片。分别在口服给药后的0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，12，24和36 h经肘静脉采集血样(3 mL)到预先添加了抗凝剂(肝素)试管中，将血液样品以6 000 r·min-1离心10 min，分离血浆并在-20 ℃下冷冻，备用。

3 结果与讨论

3.1方法的开发 为了获得更好的色谱峰形状，在可接受的保留时间和分辨率前提下，尝试了几种不同的溶剂配比优化流动相的组分。结果表明，目标化合物在乙腈∶1 mL·L-1三氟乙酸∶水(20∶40∶40)的流动相配比条件下，在很短的时间内就够获得良好分离效果[20]。在内标物的选择中，优先使用氟康唑，没有采用伊曲康唑和酮康唑，是因为在同样的色谱条件下，使用氟康唑作为内标可缩短整个分析过程的时间，在实验中的洗脱条件下，氢氯噻嗪和内标氟康唑的色谱峰均能被很好的分离，且没有其他内源物质的干扰。

3.2灵敏度 在上述实验条件下，氢氯噻嗪和内标氟康唑与其他内源性物质均有良好的分离效果。空白血浆样品、加入氢氯噻嗪和内标氟康唑的血浆样品以及志愿者血浆样品的代表性色谱图见图1。在6个随机选择的人血浆样品的色谱图中，氢氯噻嗪和内标氟康唑的保留时间分别为4.2和5.5 min，且都没有其他物质的干扰色谱峰出现，每个样品的总运行时间为6.0 min。

图1HPLC图

A.空白血浆样品；B.加入氢氯噻嗪(100 ng·mL-1)和氟康唑(300 ng·mL-1)的血浆样品；C.志愿者血浆样品；1.氢氯噻嗪；2.氟康唑。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.blank plasma sample；B.blank plasma sample spiked with HCT (100 ng·mL-1) and fluconazole(300 ng·mL-1)；C.plasma sample of the volunteers；1.hydrochlorothiazide；2.fluconazole.

3.3校准曲线的线性 在血浆中的氢氯噻嗪5～400 ng·mL-1的范围内进行了峰面积比值与质量浓度的线性回归拟合。校准曲线的回归方程：y=414.894 8x-0.842 3，r=0.999 9，其中y表示氢氯噻嗪与内标氟康唑峰面积的比值，x表示血药质量浓度。用于血浆中氢氯噻嗪测定的定量下限(LLOQ)为5 ng·mL-1。定量下限的精密度和准确度分别为8.5%和9.1%。

3.4精密度和准确度 用3个质量浓度水平(10，80和320 ng·mL-1)计算3 d的质控样品的RSD值，评估该方法的精密度。质控样品3个质量浓度的氢氯噻嗪的日内RSD值在7.7%以下，日间RSD值在8.9%以下。氢氯噻嗪在质控样品3个质量浓度的相对误差范围为-7.1%～7.9%，结果表明，该方法的精密度和准确度均在可接受范围内。

3.5回收率 在10，80和320 ng·mL-1的低、中、高3个质量浓度下，氢氯噻嗪的平均回收率分别为85.8%±5.4%，80.6%±5.0%和84.1%±4.4%(n=6)。内标氟康唑的回收率为82.7%±4.3%，见表1。

表1萃取后人血浆中氢氯噻嗪和氟康唑的回收率

Tab.1 Recovery rate test of HCT and fluconazole from human plasma after extraction

(n=6)

3.6稳定性 在室温条件下，加入氢氯噻嗪的3个质控血浆样品(10，80和320 ng·mL-1)，在3个冻融循环期的RSD值范围为5.1%～8.6%，相对误差范围为-5.8%～8.4%，表现出良好的稳定性；在-20 ℃下储存28 d的RSD值范围为4.9%～7.2%，相对误差范围为-7.1%～-5.0%，也同样表现出良好的稳定性；我们对萃取后在4 ℃条件下储存至少24 h的样品进行了测定，该方法均表现出良好的稳定性。

3.7该方法的实际应用 上述测定方法已通过了郑州儿童医院医学伦理委员会伦理批准，成功应用于测定人血浆中氢氯噻嗪的质量浓度。在20名志愿者口服50 mg 氢氯噻嗪片后，对氢氯噻嗪的主要药代动力学参数进行了计算评估。氢氯噻嗪的平均血药质量浓度-时间曲线见图2，主要药代动力学参数计算结果见表2。

图220名志愿者单次口服50mg氢氯噻嗪后的平均血药质量浓度-时间曲线

Fig.2 Mean plasma concentration-time profiles of hydrochlorothiazide after a single oral administration of 50 mg HCT to 20 Chinese healthy male volunteers

表2氢氯噻嗪的主要药代动力学参数计算结果

Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of hydrochlorothiazide

参数数值半衰期 t1/2/h11.70±1.60最大血药质量浓度Cmax/ng·mL-1275.33±38.30达峰时间tmax/h2.25±0.34药时曲线下面积AUC0→36/ng·mL-1·h2 295.75±219.15药时曲线下面积 AUC0→∞/ng·mL-1·h2 546.99±229.78

4 结论

本研究前期通过反复实验筛选，建立并验证了一种以氟康唑为内标的血浆中氢氯噻嗪质量浓度的HPLC法，氢氯噻嗪质量浓度在5～400 ng·mL-1范围内线性关系良好。氢氯噻嗪和内标氟康唑在单一洗脱模式下可获得很好的色谱分离效果，且在各自的色谱峰位置无其他内源性物质的干扰，在7 min内可完成一次完整的分析。该方法选择性好、灵敏度高，操作简单、快速，适用于临床口服氢氯噻嗪的药代动力学研究。