microRNA194过表达抑制荷瘤小鼠肝癌细胞生长的实验研究*

杨学民，李朝路，李兆阳

本研究通过构建microRNA194过表达的肝癌细胞，在体外细胞学和动物体内观察了microRNA194对肝癌细胞增殖的影响，同时初步探讨了microRNA194发挥作用的下游靶基因情况。

1 材料与方法

1.1 肝癌细胞Hep3B培养 Hep3B细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，使用含10%FBS的DMEM高糖培养基（Gibco公司）培养于细胞培养箱（37℃，5%CO2）。待细胞生长至对数生长期（融合度为70%～80%）时，行细胞传代和转染等后续实验。

1.2 microRNA194模拟物的合成 合成microRNA194模拟物（microRNA194 mimics）和阴性对照（control）序列，由上海吉玛制药技术有限公司完成（表1）。

表1 microRNA194模拟物和阴性对照序列

1.3 过表达microRNA194肝癌细胞Hep3B构建按照LipofectamineTM 2000转染液（Invitrogen公司）说明书进行细胞转染，具体步骤，1，细胞准备：转染前24 h，将合适数量的Hep3B细胞接种于96孔板，加入用含10%FBS的DMEM高糖培养基100 μl/孔培养，使细胞融合度达到50%～70%；2，转染液的配制：A液：每孔microRNA194模拟物和阴性对照各4 pmol，溶于不含血清的Opti-MEM培养基（Gibco公司）25 μl；B 液：每孔 0.2 μl的LipofectamineTM 2000转染液溶于不含血清的Opti-MEM培养基25 μl，静置5 min。将A液与B液混匀，每孔共50 μl，静置20 min，以利于充分形成转染复合物；3，吸弃96孔板上清培养液，PBS洗涤，每孔加入不含血清的Opti-MEM培养基50 μl，随后加入第2步中配制的转染液（50 μl/孔），将96孔板置于细胞培养箱中继续培养6 h。然后，将培养上清液吸弃，加入新鲜配置的含10%FBS的DMEM高糖培养基，继续培养48 h；4，采用荧光定量PCR法检测microRNA194 mRNA水平，验证是否成功构建过表达microRNA194的肝癌细胞Hep3B，检测microRNA194的引物序列见表2，由上海生工生物工程有限公司合成。

表2 荧光定量PCR反应引物序列

1.4 过表达microRNA194荷瘤小鼠的构建 取30只健康清洁级Balb/c裸鼠（4周龄，15～20 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司）。采用随机数字表法随机分配为microRNA194过表达组15只和对照组15只。使用1%戊巴比妥钠行腹腔麻醉，使用75%酒精对腋下皮肤进行局部消毒，使用1 ml注射器吸取Hep3B细胞悬液200 μl（2×106）皮下接种，分别使用microRNA194模拟物转染的Hep3B细胞或用阴性对照序列转染的Hep3B细胞。

1.5 肿瘤体积和质量监测 在接种Hep3B细胞后，每隔5 d，使用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，按照公式（体积=0.52×长×宽2）计算肿瘤体积。在接种细胞后21 d，将Balb/c裸鼠处死，小心分离肿瘤，称质量后将肿瘤组织保存于-80℃。

1.6 肿瘤组织microRNA194和IGF1R mRNA水平检测 采用荧光定量PCR法检测，microRNA194和胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）mRNA的引物序列参照文献进行合成[1]（表2，上海生工生物工程有限公司）。依次进行组织mRNA提取、逆转录合成cDNA和荧光定量PCR检测，将对照组microRNA194和IGF1R mRNA水平设定为 1，与microRNA194过表达组进行比较。

1.7 肿瘤组织IGF1R蛋白表达检测 采用Western blot法，使用抗IGF1R抗体和抗内参GAPDH蛋白抗体（Abcam公司）检测，使用Image Pro Plus 6.0软件分析IGF1R蛋白与内参GAPDH蛋白条带的灰度值，IGF1R蛋白与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值即为IGF1R蛋白的相对含量。

1.8 统计学分析 应用SPSS 20.0软件行数据分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。当P＜0.05时，代表具有统计学差异，以*表示；当P＜0.01时，代表具有显著性统计学差异，以**表示。

2 结果

2.1 两组细胞microRNA194 mRNA水平比较 结果显示，转染microRNA194模拟物的过表达组与对照组相比，microRNA194 mRNA水平显著升高（P＜0.01，图1），表明我们成功构建了过表达microRNA194的肝癌细胞。

图1 两组细胞microRNA194 mRNA水平比较

2.2 两组荷瘤小鼠肝癌组织microRNA194 mRNA水平比较 结果显示，microRNA194过表达肿瘤microRNA194 mRNA水平比对照组显著升高（P＜0.01，图2），表明我们成功构建了过表达microRNA194的荷瘤小鼠。

图2 两组小鼠肝癌组织microRNA194 mRNA水平比较

2.3 两组小鼠肿瘤体积和质量比较 结果显示，在接种细胞后第6 d开始，microRNA194过表达组肿瘤体积显著小于对照组（P＜0.05），并随着时间的延长，差异逐渐变得更显著（P＜0.01，图3），两组小鼠肿瘤质量有类似的变化（资料未列出），表明过表达microRNA194可以抑制肝肿瘤生长。

图3 两组小鼠肝癌体积比较

2.4 高表达的microRNA194降低肿瘤组织IGF1R mRNA水平并抑制其蛋白表达 microRNA194过表达组IGF1R mRNA水平显著低于对照组（P＜0.01，图4），IGF1R蛋白表达量也显著降低（图5），表明高表达的microRNA194可以抑制IGF1R的表达，可能为其抑制肝肿瘤生长的分子机制之一。

图4 两组小鼠肝癌组织IGF1R mRNA水平比较

图5 两组小鼠肝癌组织IGF1R蛋白表达的比较

3 讨论

有人通过对17例不同病因导致的肝癌患者55个临床样本进行microRNA高通量分析，发现一系列microRNA在肝癌的早期阶段就发生了差异性表达，并参与随后的肝癌进展[1-5]，这些microRNA包括miR-21-5pmiR-375、miR-200a-3p、miR-200b-3pmiR-141-3p、miR-429、miR-16-5p 等[6-9]。

microRNA194也被发现在肝脏疾病中发挥重要的调节作用，包括肝纤维化、乙型肝炎发病等[6，20]。研究报道microRNA194和microRNA150水平在肝纤维化大鼠模型的肝脏组织中显著降低，它们的过表达可以抑制肝细胞增殖、表达平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白等细胞外基质，从而在肝脏纤维化过程中发挥抑制作用[15-20]。但是，目前关于microRNA194在肝癌发病中的相关报道仍然较少，仅有少数几篇报道，如有人发现，过表达的microRNA194可以降低N-cadherin的表达，从而抑制肝癌细胞的迁移[14]。关于microRNA194抑制肝癌转移的具体机制，也有人发现可能与其抑制下游靶基因丝裂原激活蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）的表达有关[6]。尽管如此，microRNA194对肝癌细胞的增殖、凋亡等其他生物学功能仍未阐明，而且具体的信号通路和下游靶基因复杂，仍有待更充分的挖掘。

本文研究了microRNA194过表达对肝癌组织生长的影响，通过细胞转染的方法构建了过表达microRNA194的肝癌细胞Hep3B，并将其接种于Balb/c裸鼠皮下，采用荧光定量PCR法验证了荷瘤小鼠肝癌组织中microRNA194 mRNA呈高水平，因此我们成功构建了microRNA194高水平的荷瘤小鼠模型。随后，我们对肿瘤的体积和质量进行了检测，发现过表达的microRNA194可以显著抑制肝肿瘤的生长。

为了进一步探讨microRNA194的高表达抑制肝癌生长的具体机制，我们对microRNA194下游靶基因的表达情况进行了检测。在研究microRNA194在骨肉瘤中的作用机制时，有人通过生物信息学方法预测、荧光定量PCR和Western blot等方法检测发现，microRNA194可能通过与IGF1R的3’端非编码区结合，抑制IGF1R的表达，从而在骨肉瘤的细胞增殖和转移中发挥抑制作用[15]。我们在本文中也研究了microRNA194过表达对IGF1R表达的影响，结果发现microRNA194过表达组与对照组相比，IGF1R mRNA水平显著降低，表明高表达的microRNA194可以抑制IGF1R的表达，有可能参与了microRNA194高表达抑制肝肿瘤生长的分子机制。