多次人脐带间充质干细胞移植治疗失代偿期乙型肝炎肝硬化患者临床研究

张骏飞，宋海燕，陈曦，潘劲劲，刘力伟，陈从新，刘波

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潜能和自我复制能力，在特定微环境中可分化成肝干细胞或肝样细胞，修复和重构受损的肝脏结构和功能，已成为近年来肝病治疗领域的新方法[1-4]。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs） 与骨髓MSCs比，有着来源丰富、取材方便、分化潜能大、增殖能力更强、免疫原性弱等显著优点[5，6]。研究表明，HUC-MSCs有促进肝脏再生、改善肝硬化患者肝功能的作用[6，7]。但一次细胞移植能否获得好的疗效？多次移植是否会增加癌化风险和减少其它并发症的发生等问题，尚缺乏临床对照研究。本研究通过分离、培养、扩增HUC-MSCs单次移植与多次移植治疗肝硬化患者，探讨了其对乙型肝炎肝硬化患者临床症状和肝功能的影响，评价了其疗效和安全性。

1 对象与方法

1.1 临床资料 2012年1月～2015年1月我科诊治的乙型肝炎肝硬化患者60例，男性82例，女性16例；年龄 26～7l岁，平均年龄为（45.3±4.3）岁。诊断符合中华医学会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）的诊断标准[8]。排除乙型肝炎以外原因引起的肝硬化、或合并恶性肿瘤、吸毒或饮酒、近半年内服用过损肝药物或存在心、肺、肾等脏器功能衰竭者。本研究在中国临床试验注册中心注册（ChiCTR-ONC-12002936），且已经过我院医学伦理委员会批准，患者及其家属签署知情同意书。

1.2 HUC-MSCs的分离、培养和表型鉴定[6，9]自我院产科获得足月妊娠健康胎儿胎盘（孕妇签署知情同意书），排除人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染者。胰蛋白酶、胶原酶、胶原蛋白和DMEM培养基购自Gibco公司，抗-CD29PE、抗 CD34FITC、抗 CD44PE 和 抗 CD45-FITC购自贝克曼公司。采用贴壁法分离HUC-MSCs。取培养至第3代的HUC-MSCs（图1），制成1×106/ml细胞悬液，使用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况，结果细胞 CD44阳性率为99.2%，CD34为阴性，CD29阳性率为99.8%，CD45为阴性。同时，取培养基上清行细菌培养、真菌培养及检测支原体感染标志物和内毒素。间充质干细胞纯度达99%，经台盼蓝活细胞染色鉴定，细胞存活率为99%。经各项检测合格后，制备成间充质干细胞悬液20 ml，含HUC-MSCs约4×108个。

1.3 治疗方法 将患者分为对照组、单次组和多次细胞移植组。在对照组，采用护肝、退黄、抗病毒等对症支持治疗，必要时给予利尿、输注人血白蛋白。对有消化道出血者，予以止血、输血，给予肝性脑病者门冬氨酸鸟氨酸和支链氨基酸处理；在常规治疗基础上，给予部分患者HUC-MSCs肝内移植治疗1次，而另一些患者则接受2次或3次HUC-MSCs移植治疗（每次间隔>12个月），随访三组患者36个月。细胞移植方法：依据病情，在DSA引导下经皮穿刺股动脉，插管至肝固有动脉，注射造影剂，将制备好的HUC-MSCs悬液20 ml缓慢注入肝动脉左右分支，各10 ml。术毕、拔管，穿刺点加压包扎24 h，穿刺侧下肢制动24 h，行介入后常规护理。在凝血酶原时间不延长的患者，采用经超声引导下经皮肝内门静脉穿刺，将HUC-MSCs缓慢注入门静脉左右分支，各10 ml，术后敷料覆盖穿刺点，回病房卧床休息8 h，行肝穿刺后常规护理。随访期间，常规行超声检查，评估肝脾大小情况。

1.4 统计学方法 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析或成对资料的t检验，计数资料的比较采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

图1 干细胞培养 镜下见漩涡状生长的梭形P3人脐带间充质干细胞

2 结果

2.1 一般情况 两组接受细胞移植患者均顺利完成手术。在随访期间，在20例单次移植组，死亡3例（15%），其中2例在移植后36周和71周死于慢性肝衰竭，1例在136周时死于上消化道出血；在20例接受多次细胞移植患者，死亡2例（10%），其中1例在移植后第25周时死于慢性肝衰竭，1例在40周时死于上消化道出血；在20例对照组中，死亡5例（25%），其中2例在随访第12周和141周死于肝性脑病，2例在第60周和第86周时，死于慢性肝衰竭，1例在第120周死于上消化道出血。三组病死率相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 三组肝功能指标变化的比较 治疗前，三组血清TBIL、ALB、INR和Child-Pugh评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在随访12个月和24个月时，单次移植组血清ALB水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在随访36个月结束时，多次移植组血清TBIL、ALB、INR和Child-Pugh评分与单次移植组和对照组比，均有显著统计学差异（P＜0.05，表1）。

2.3 各组肝、脾脏大小比较 入组前，三组患者肝脏最大平扫面积、脾脏长度和厚度比较，无统计学差异（P＞0.05）；在随访36月结束时，多次接受细胞移植患者肝脏最大平扫面积较对照组显著增大、脾脏长度和厚度较对照组显著缩小，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

2.4 三组并发症发生率比较 三组并发症发生率比较，见表3。

表1 三组肝功能指标（±s）比较

表1 三组肝功能指标（±s）比较

与对照组比，①P<0.05；与单次移植组比，②P<0.05

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表2 三组肝脏和脾脏大小（±s）比较

表2 三组肝脏和脾脏大小（±s）比较

与对照组比，①P<0.05

例数 肝脏面积（cm2） 脾脏长度（mm） 脾脏厚度（mm）对照组 治疗前 20 140.9±16.3 150.6±23.5 48.1±9.9治疗后 15 134.3±15.6 154.7±20.1 49.9±8.7单次移植 治疗前 20 139.9±17.6 149.4±24.5 48.2±9.36治疗后 17 139.6±12.4 148.5±24.1 47.6±10.8多次移植 治疗前 20 138.2±17.8 151.4±20.5 48.2±9.3治疗后 18 140.2±14.5① 145.2±19.3① 45.8±9.2①

表3 三组并发症发生率（%）比较

3 讨论

我们前期研究发现，HUC-MSCs可通过抑制淋巴细胞增殖和分化，促进抑制性细胞因子的分泌，减少肝硬化患者发生肝衰竭的概率[10-12]。多数研究提示干细胞移植治疗肝硬化患者可改善肝功能，且无严重的并发症[13]。

本研究进一步分析比较了单次和多次HUC-MSCs移植治疗失代偿期乙型肝炎肝硬化患者，结果显示在随访12个月时，多次移植组肝功能改善程度显著优于单次移植组。在随访24个月和36个月时，接受多次HUC-MSCs移植患者肝功能指标进一步改善，提示一次细胞移植不能巩固疗效，而往往需要多次行细胞移植治疗。在肝内移植后，HUC-MSCs可直接到达受损的肝损伤部位，一方面可分化成新的肝脏功能细胞，或还能“催醒”自身肝脏细胞；另一方面通过HUC-MSCs分泌的各种细胞因子，修复和营养受损的肝细胞[14，15]。但是，随着时间的推移，这种功能降低，肝功能可能继续恶化。故多次给予干细胞移植，不断修复继续受损的肝细胞，得以使肝功能稳定。

国内有学者[16，17]研究表明干细胞移植后肝脏最大横截面积增大，脾脏体积缩小。我们认为，细胞移植入肝内后，干细胞可能转化为肝样细胞，增加肝细胞数量。

许多学者研究证实，干细胞移植治疗肝硬化疗效肯定，操作安全[18-19]。在细胞移植术后少数患者出现发热，多为低热，经对症处理后，体温恢复正常，未影响继续治疗。三组患者均有肝癌和肝衰竭发生，但发生率比较无统计学差异，说明三组患者原发性肝癌和肝衰竭的发生与HUC-MSCs移植无显著相关，为与其疾病的演变过程有关。我们认为，HUC-MSCs肝内移植不会增加发生肿瘤的风险。接受多次细胞移植患者腹水发生率低，血清白蛋白上升，肝功能指标稳定。

本研究观察了细胞移植前后肝脾大小的变化，但由于只是经超声检查获得的数据，结果的可信度还需要证实。下一步将采用CT扫描，计算肝脾体积的方法，使细胞移植前后结果更具可比性。